文献类型： 中文期刊

作者： 冯春莹 ¹ ; 张朝霞 ¹ ; 刘云飞 ¹ ; 黄丽 ¹ ; 翁长江 ¹ ;

作者机构： 1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室/黑龙江省兽医免疫学重点实验室

关键词： 非洲猪瘟病毒;p54蛋白;单克隆抗体;抗原表位

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2024 年 57 卷 019 期

页码： 3936-3944

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】获得可溶性非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）p54蛋白和抗p54蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb），并分析其识别的线性抗原表位，为p54蛋白结构和功能的研究及血清学诊断试剂的研发奠定基础。【方法】构建了重组原核表达质粒pET-21a-E183L，将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，表达并利用Ni2+柱和分子筛纯化得到p54重组蛋白。以该蛋白为抗原免疫5周龄SPF级BALB/c小鼠，每两周免疫一次，共免疫3次，首免时将p54蛋白与弗氏完全佐剂混匀乳化（150μg/只），二免、三免使用弗氏不完全佐剂。三免7 d后对小鼠进行尾部采血，使用ELISA方法测定小鼠血清抗体效价，选取效价高的小鼠进行加强免疫。3 d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合，利用重组p54蛋白作为包被抗原,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆纯化,直至筛出能够稳定分泌抗体的mAb细胞株，并制备腹水。以pCAGGS-Flag-E183L质粒转染的HEK293T细胞和ASFV Pig/HLJ/18株感染的猪肺泡巨噬细胞（PAMs）为抗原，以筛选得到的mAb为一抗，进行Western blot鉴定和间接免疫荧光试验（IFA）。使用单抗亚类鉴定试剂盒检测该mAb重链和轻链类型。随后，将p54蛋白逐步截短并与GST标签融合表达后进行Western blot检测，鉴定该mAb识别的抗原表位。【结果】将构建的原核表达质粒pET-21a-E183L(54-183aa)转化至BL21(DE3)感受态细胞中，使用IPTG进行诱导后，p54重组蛋白大部分以可溶的形式在上清中表达，分子量约为17 kDa。以纯化得到p54重组蛋白免疫小鼠，三免后7 d的血清效价为1:409 600，可进行细胞融合，经四次筛选和亚克隆后，获得能够稳定分泌p54蛋白mAb的细胞株，命名为5B11，成功制备腹水并纯化。Western blot和IFA试验结果显示，制备的mAb能够特异性识别HEK293T细胞中表达及ASFV感染PAMs中的p54蛋白。mAb亚类鉴定结果显示重链类型为IgG1型，轻链类型为κ链。该mAb识别的抗原表位序列为80VTPQPGTSKPA90。【结论】利用原核表达体系可溶性表达了ASFV p54蛋白的第54-183位氨基酸,并以纯化的蛋白为抗原制备了抗p54蛋白的mAb，并对其识别的抗原表位进行鉴定，丰富了p54蛋白的抗原表位信息，为ASFV血清学检测提供了基本材料。