文献类型： 中文期刊

作者： 贺筱萍 ¹ ; 张元峰 ¹ ; 刘学敏 ¹ ; 黄丽 ¹ ; 翁长江 ¹ ;

作者机构： 1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室/黑龙江省兽医免疫学重点实验室

关键词： 非洲猪瘟病毒;pD345L蛋白;单克隆抗体;抗原表位

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2025 年 58 卷 016 期

页码： 3345-3356

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】制备非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）pD345L蛋白（pD345L）的单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs），并分析其识别的线性B细胞表位，为探究pD345L在ASFV感染与致病中的功能奠定基础。【方法】构建pET-28a-D345L重组原核表达质粒，将其转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，表达并用亲和层析方法纯化重组的pD345L蛋白（rpD345L）。将纯化的rpD345L与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫5周龄SPF级BALB/c小鼠，每隔两周免疫一次，共免疫3次。第二次和第三次免疫均用弗氏不完全佐剂乳化。第三次免疫一周后通过小鼠颌下静脉采血，分离血清，利用ELISA方法检测血清抗体效价，选取抗体效价高的小鼠加强免疫。免疫3 d后取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合。将重组GST-pD345L作为包被抗原，利用ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，经过3次筛选得到能够稳定分泌pD345L mAbs的杂交瘤细胞株，注入小鼠腹腔制备腹水。使用单抗亚类鉴定试剂盒鉴定mAbs的重、轻链类型。利用外源过表达的pD345L和ASFV HLJ/18株感染的猪肺泡巨噬细胞（PAMs）为抗原，用制备的mAbs作为一抗，分别进行Western blot和间接免疫荧光（IFA）鉴定。随后将截短的pD345L与GST融合表达，用筛选的mAbs鉴定抗原表位，分析鉴定的抗原表位在不同ASFV毒株中的保守性。【结果】IPTG诱导后，pD345L以包涵体形式表达，分子量为40.5 kDa。将其免疫BALB/c小鼠后经间接ELISA方法筛选得到2株稳定分泌pD345L mAbs的杂交瘤细胞株，命名为10H3和5G1。亚类鉴定结果显示，2株mAbs重链类型均为IgG1型，轻链类型为κ链，抗体效价为1﹕1 638 400。Western blot和IFA结果显示，制备的mAbs均能识别天然表达的pD345L。经Western blot确定抗原表位，结果显示10H3和5G1 mAbs的最小线性B细胞表位分别为¹METFVRLFKD¹⁰和³²¹YEKICCSEES³³⁰，这两个抗原表位在ASFV不同毒株中具有保守性。【结论】本研究原核表达并纯化了rpD345L，制备了2株pD345L mAbs，并鉴定了其识别的抗原表位，且这2株mAbs均能有效识别ASFV感染过程中表达的pD345L，为进一步研究ASFV pD345L功能奠定基础。