文献类型： 中文期刊

作者： 周函蓉 ¹ ; 苏世博 ¹ ; 孙明霞 ¹ ; 蒙靓 ¹ ; 杨巍 ² ; 史鑫琪 ¹ ; 李鑫 ¹ ; 安同庆 ¹ ; 蔡雪辉 ¹ ; 王海伟 ¹ ; 孟凡丹 ¹ ;

作者机构： 1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室

2.东北农业大学动物医学学院

关键词： A型塞内卡病毒;单克隆抗体;双抗体夹心ELISA方法

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2024 年 46 卷 010 期

页码： 1034-1042

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 为建立一种快速检测A型塞内卡病毒（SVA）的方法，本研究利用氯化铯密度梯度离心法纯化的SVA粒子免疫BALB/c小鼠3次，采用杂交瘤技术制备SVA单克隆抗体（MAb）。结果显示，共获得7株能够稳定分泌SVA MAb的杂交瘤细胞株。采用过碘酸钠法将其中5株MAb标记HRP（MAb-HRP），并采用ELISA法检测标记效果。将7株MAb与5株MAb-HRP两两组合进行抗体配对试验。结果显示，5株MAb均标记上HRP，且其中各稀释度标记的MAb 2C8-HRP的反应性均最强；当MAb 2G7作为捕获抗体，MAb 2C8-HRP作为检测抗体时，P/N值最大，表明这两种MAb的配对效果最好。在此基础上，通过优化各反应条件初步建立检测SVA的双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）方法。利用建立的DAS-ELISA方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、O型和A型口蹄疫病毒和SVA，结果显示，该方法仅能检测SVA，其他常见的猪源病毒均为阴性结果，表明该方法特异性强。利用本研究建立的DAS-ELISA方法分别检测系列稀释的SVA上清液(1～1:80 000，对应的病毒滴度分别为10^7.5TCID₅₀/mL～1.25×10^2.5TCID₅₀/mL)和2倍倍比稀释的SVA猪阳性猪血清（1:2～1:256），同时采用猪塞内卡病毒抗原（SVA-Ag）ELISA试剂盒分别检测上述SVA上清液和SVA猪阳性血清，评估本研究建立DAS-ELISA方法的敏感性。结果显示SVA稀释40 000倍后，其OD_450nm值仍大于临界值0.115，即该方法对SVA上清液的检测限为2.5×10^2.5TCID₅₀/mL，且1:64倍稀释的SVA猪阳性血清样品仍为阳性；（SVA-Ag）ELISA结果显示，该方法检测的SVA最大稀释度为1:20000，即对SVA上清液的检测限为5×10^2.5TCID₅₀/mL，且仅能检测到稀释至32倍的SVA猪阳性血清，均低于本实验建立的DAS-ELISA方法，表明该方法敏感性高。对4份SVA猪阳性血清和1份SVA猪阴性血清采用DAS-ELISA方法进行批内和批间重复性试验，结果显示批间和批内重复性试验的变异系数均在10%以下，重复性较好。对采集的205份疑似SVA感染的猪扁桃体组织、鼻咽拭子及血清样品分别采用DAS-ELISA及RT-PCR方法检测。DAS-ELISA的检测结果显示，36份样品为阳性，169份样品为阴性；RT-PCR检测结果显示，50份样品为阳性，155份样品为阴性。经计算两种方法的阳性符合率为72%（36/50），总符合率为93%（191/205）。以上结果表明，本研究建立的DAS-ELISA适用于大规模多种临床样品的检测，为SVA的检测及流行病学调查提供技术支撑。