文献类型： 中文期刊

作者： 王建国 ¹ ; 陈凡若 ¹ ; 鹿萍 ¹ ; 臧鑫鑫 ¹ ; 党光辉 ¹ ; 姜艳艳 ¹ ; 崔宁 ¹ ; 冯婷婷 ¹ ; 张嘉俊 ¹ ; 王慧 ¹ ; 崔莹莹 ¹ ; 崔子寅 ¹ ; 刘思国 ¹ ;

作者机构： 1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室;辽宁中医药大学

关键词： 副结核分枝杆菌;GDSL脂肪酶;MAP＿2739;酶学特性

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2023 年 04 期

页码： 331-338

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 本实验室前期研究发现了未见报道的副结核分枝杆菌(MAP) GDSL脂肪酶家族蛋白MAP＿2739。为进一步分析MAP＿2739的酶学特性，本实验利用生物信息学网站和软件对MAP＿2739保守结构域、二级结构、3D同源建模等分析，进一步确认其属于GDSL脂肪酶家族蛋白。以MAP参考株基因组DNA为模板，PCR扩增获得map＿2739目的基因约891 bp，克隆于表达载体p ET-22b中，构建重组质粒p ET-22b-map＿2739，转化大肠杆菌感受态细胞，经IPTG诱导表达、蛋白复性、Ni-TNA柱亲和层析纯化后，利用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达及纯化效果，并通过western blot鉴定。结果显示，获得了以包涵体形式表达的经复性的纯化重组MAP＿2739蛋白(rMAP＿2739)。利用该蛋白制备兔多克隆抗体，通过ELISA方法检测，多抗血清效价为1:51 200。经差速离心法分离MAP参考株组分，利用该多克隆抗体为一抗，通过western blot检测，结果显示在细胞壁、细胞膜和细胞浆均出现35 ku的特异性条带，表明MAP＿2739为胞外蛋白。以对硝基苯基酯(p-NPs)为底物进行酶活测定，结果显示MAP＿2739蛋白为脂肪酶，可水解短链和长链脂肪酸，其最适酶反应p H值为9.0，且r MAP＿2739蛋白经巴氏消毒法预处理后，仍具有脂肪酶活性。以重组质粒p ET-22b-map＿2739为模板，利用各定点突变引物，经PCR扩增各突变的map＿2739基因，并测序后转化大肠杆菌感受态细胞，通过western blot鉴定蛋白表达及纯化情况，并进行了酶活测定分析，结果显示获得各定点突变纯化蛋白，确定S46和D204为MAP＿2739的酶活性位点。综上所述，本研究首次证明MAP＿2739是MAP胞外GDSL脂肪酶，该结果为进一步研究其在MAP致病中的作用机制奠定了基础。