文献类型： 中文期刊

作者： 张镇钧 ¹ ; 冯婷婷 ² ; 聂蝉蝉 ² ; 段祎凡 ² ; 陈春文 ² ; 郭若男 ¹ ; 高云洁 ² ; 李梦雨 ² ; 崔莹莹 ² ; 党光辉 ² ; 刘思国 ² ;

作者机构： 1.新疆农业大学动物医学学院

2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室

关键词： CRISPR/Cas9;转录因子EB蛋白;自噬;结核分枝杆菌

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2025 年 47 卷 006 期

页码： 614-622

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 转录因子EB(TFEB)作为自噬的主要转录调节因子，通过调控细胞自噬体和溶酶体相关基因的表达影响自噬的发生。为研究TFEB在结核分枝杆菌（MTB）介导细胞自噬中的作用，本实验采用CRISPR/Cas9原理构建重组质粒pSpCas9(BB)-2A-GFP-tfeb，并测序鉴定正确后电转化小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7细胞，简写为WT细胞），经流式细胞仪筛选GFP阳性单克隆细胞，经PCR及western blot鉴定，将鉴定正确的细胞连续传10代，每隔3代均经western blot鉴定。结果显示，经流式细胞术共筛选到25株出现绿色荧光的单克隆细胞，对这些细胞纯化后经PCR鉴定并测序结果显示，仅一株单克隆细胞敲除tfeb中PAM序列（AGG）前的第3位碱基；western blot鉴定结果显示，相比正常细胞，该细胞无57 ku的特异性条带，且每隔3代该细胞均无该57 ku的特异性条带，表明tfeb基因缺失细胞系Δtfeb RAW264.7正确构建，且其遗传稳定性较强。将MTB H37Ra株分别感染WT细胞和Δtfeb RAW264.7细胞，12 h后经western blot检测各组细胞中自噬相关蛋白LC3-II和溶酶体相关膜糖蛋白1(LAMP1)的表达水平，通过RT-qPCR检测自噬相关基因maplc3、ctsb、lamp1、tpp1的转录水平，采用激光共聚焦试验检测TFEB对H37Ra诱导细胞自噬流形成的影响。Western blot和RT-qPCR结果显示，与未感染的两种细胞相比，H37Ra菌株感染的WT细胞中LC3-II和LAMP1蛋白的表达量均极显著升高（P<0.01、P<0.001）；自噬相关基因maplc3和溶酶体相关基因lamp1、ctsb和tpp1的转录水平均显著和极显著升高（P<0.05、P<0.01）。H37Ra菌株感染的Δtfeb RAW264.7细胞中上述两种蛋白的表达量均无显著差异，其上述两种蛋白的表达水平均低于WT细胞且该细胞中上述自噬体和溶酶体相关基因的转录水平均无显著差异。激光共聚焦试验结果显示，与WT细胞相比，H37Ra株感染的WT细胞中黄色荧光（成熟自噬体）和红色荧光（溶酶体）的数量均极显著增加（P<0.01），且自噬流通畅，表明WT细胞发生了自噬；H37Ra株感染的Δtfeb RAW264.7细胞与未感染的该细胞中二者的荧光数量均无显著差异，且二者荧光的数量均比WT细胞整体降低，自噬流受阻。上述结果表明，本研究构建了tfeb基因稳定缺失的细胞系Δtfeb RAW264.7，且首次证实TFEB是MTB介导巨噬细胞自噬的关键宿主因子，在巨噬细胞自噬过程中发挥关键作用，本研究为深入探究TFEB在MTB介导巨噬细胞自噬中的作用提供了细胞模型和参考依据。