文献类型： 中文期刊

作者： 李允静 ¹ ; 任雪贞 ² ; 肖芳 ¹ ; 晋芳 ² ; 高鸿飞 ¹ ; 景琦 ² ; 武玉花 ¹ ; 孙全 ² ; 李俊 ¹ ; 王培 ² ; 翟杉杉 ¹ ; 金石桥 ² ; 吴刚 ¹ ;

作者机构： 1.中国农业科学院油料作物研究所/农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室/农业农村部植物生态环境安全检验测试中心(武汉)/农业农村部农业转基因生物溯源重点实验室

2.全国农业技术推广服务中心

关键词： 耐除草剂大豆;种子;二重实时荧光PCR;转化体纯度

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2024 年 57 卷 023 期

页码： 4698-4711

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】耐除草剂大豆SHZD3201、DBN9004、中黄6106（ZH10-6）相继获得生产应用安全证书，针对这3个转化体建立二重实时荧光PCR检测方法，应用于大豆转基因转化体种子纯度的精准、快速鉴定，为大豆转基因品种种子质量安全监管提供技术支撑。【方法】搜集耐除草剂大豆SHZD3201、DBN9004和中黄6106 3个转化体以及4个大豆内标准基因Lectin的实时荧光PCR方法，通过比较ΔCt值，遴选出二重实时荧光PCR的最佳大豆内标准基因检测方法；设置转化体和Lectin不同引物/探针浓度，优化二重实时荧光PCR的反应体系；根据不同类型的特异性测试样品测试二重实时荧光PCR方法的特异性；设置2 000、200、20、10、5和1拷贝的梯度样品，测试方法的检出限。利用一步提取液快速研磨单粒种子，以稀释后的粗提液直接作为模板进行二重实时荧光PCR扩增，进而开展耐除草剂大豆SHZD3201、DBN9004和中黄6106单粒种子纯度的检测。【结果】经测试计算最小ΔCt值，在SHZD3201、DBN9004和中黄6106转化体二重实时荧光PCR中，遴选出最佳大豆内标准基因Lectin检测方法。经优化，SHZD3201/Lectin二重实时荧光PCR反应体系中，SHZD3201转化体的引物/探针浓度为0.3μmol·L^-1/0.15μmol·L^-1,Lectin的引物/探针浓度为0.3μmol·L^-1/0.15μmol·L^-1;DBN9004/Lectin二重实时荧光PCR反应体系中，DBN9004转化体的引物/探针浓度为0.4μmol·L^-1/0.2μmol·L^-1,Lectin的引物/探针浓度为0.4μmol·L^-1/0.2μmol·L^-1；中黄6106/Lectin二重实时荧光PCR反应体系中，中黄6106转化体的引物/探针浓度为0.4μmol·L^-1/0.2μmol·L^-1,Lectin的引物/探针浓度为0.5μmol·L^-1/0.25μmol·L^-1。3种方法特异性良好，检出限均达10个拷贝。利用100粒模拟单粒种子样本，快速研磨，模板稀释5倍后，采用二重实时荧光PCR快速扩增，成功地检测了SHZD3201、DBN9004和中黄6106种子转化体纯度。【结论】成功建立了耐除草剂大豆SHZD3201/Lectin、DBN9004/Lectin和中黄6106/Lectin的二重实时荧光PCR方法，结合一步提取液的DNA快速提取方法，实现了大豆转基因种子转化体纯度精准快速检测。