文献类型： 中文期刊

作者： 郭奎 ¹ ; 张泽楠 ¹ ; 李帅杰 ¹ ; 初晓雨 ¹ ; 王垚鑫 ¹ ; 郭巍 ¹ ; 胡哲 ¹ ; 王晓钧 ¹ ;

作者机构： 1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室

关键词： 马流产沙门氏菌病;ompA;通用型;iELISA;诊断

期刊名称： 中国农业科学

ISSN：

年卷期： 2023 年 012 期

页码： 2421-2430

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】通过筛选引起马流产的4种沙门氏菌（Salmonella）共同的优势抗原，建立一种敏感高、特异强的通用型间接ELISA（iELISA）抗体检测方法，实现对马群中沙门氏菌抗体的快速高通量检测。【方法】首先利用马流产沙门氏菌阳性血清、阴性血清分别与马流产沙门氏菌全菌抗原进行免疫共沉淀（pull down）试验，筛选出马流产沙门氏菌优势抗原；根据质谱分析结果找到优势抗原基因，将优势抗原基因与其他3种致马流产沙门氏菌病的鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌进行序列比对验证其保守性；其次根据抗原性分析对优势抗原编码基因进行分段表达，设计3对引物，利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增沙门氏菌优势抗原基因并将其分别克隆至原核表达载体pET28a；测序分析后将构建正确的重组质粒分别转化入大肠杆菌（Escherichia coli E.coli）Rosetta（DE3）中并加入0.6 mmol·L^-1异丙基-β-D-硫代半乳糖甘（Isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG）进行诱导表达，观察蛋白的表达形式；蛋白纯化后通过Western blot验证蛋白的反应原性和广谱性；然后利用纯化后蛋白作为包被抗原，通过对包被抗原量、血清和第二抗体浓度等条件进行优化建立马流产沙门氏菌病间接ELISA抗体诊断方法，并对该方法的特异性、敏感性进行评估。最后将该方法应用于试验感染马血清及临床样本的检测，并将检测结果同凝集试验结果比较。【结果】筛选出的马流产沙门氏菌优势抗原是ompA（Outer Membrane Protein, OMP），通过序列比对，该蛋白氨基酸序列与同属鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌同源性99.4%—100%，具有很好的保守性；PCR扩增后成功获得3条与预期符合的目的基因；成功构建了pET28a-ompA1、pET28a-ompA2、pET28a-ompA33个重组质粒。SDS-PAGE结果表明，在24℃、0.6 mmol·L^-1 IPTG诱导5 h下，含有pET28a-ompA1、pET28a-ompA2、pET28a-ompA3的重组菌均表达了相应蛋白，其中重组ompA1和ompA2蛋白以包涵体形式表达，重组ompA3蛋白以可溶性形式表达；Western blot显示，重组蛋白ompA3可与马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌阳性血清发生特异性反应，证明重组ompA3蛋白具有良好的反应原性，可以作为沙门氏菌属抗血清检测用抗原；以ompA3蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法，在最大P/N比确定的最佳反应条件如下：最佳包被抗原浓度为1μg·mL^-1，待检血清（1﹕200）37℃作用1 h，酶标抗马二抗（1﹕10 000稀释），TMB在37℃孵育10 min，待检血清OD450＞0.143判定为阳性，特异性试验结果显示，该包被抗原与常见马传染病阳性血清无交叉反应。通过对沙门氏菌静脉注射感染马的血清样品进行抗体检测，iELISA可以持续监测抗体阳性到116 d，相比微量凝集（69 d）多监测了47 d，因此iELISA具有更好的敏感性。利用建立的iELISA方法对8个不同牧场180份血清进行抗体检测，其抗体平均阳性检出率为63.3%，比微量凝集阳性检出率高53.9%。【结论】成功筛选到了马流产沙门氏菌病4种病原的共同优势抗原ompA，实现了对该蛋白的可溶性表达，建立了马流产沙门氏菌病通用型iELISA抗体诊断方法，该方法可以实现对临床样本马流产沙门氏菌抗体的检测，该方法具有特异性强、敏感性高，可以作为马流产沙门菌病抗体检测的一种有效工具。