文献类型： 中文期刊

作者： 赵济钰 ¹ ; 王璐 ² ; 孙婧 ³ ; 王春来 ³ ; 李刚 ³ ; 刘思国 ³ ;

作者机构： 1.东北农业大学动物医学学院

2.新疆农业大学动物医学学院

3.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队

关键词： 胸膜肺炎放线杆菌;MnmE基因;基因突变株

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN：

年卷期： 2023 年 003 期

页码： 225-231

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 为了探究t RNA修饰酶Mnm E对胸膜肺炎放线杆菌（APP）生长特性及致病性的影响，本研究以血清7型APP S8株DNA为模板经PCR分别扩增其Mnm E基因的保守结构域及全长基因，分别构建重组质粒pmnm E及pls88-Mnm E，并经PCR鉴定正确后将重组质粒pmnm E通过接合转移方式导入受体菌S8中，利用氯霉素抗性筛选Mnm E基因缺失株（S8△Mnm E），并经PCR和测序鉴定；将重组质粒pls88-Mnm E电转化至S8△Mnm E感受态细胞中，经卡那抗性筛选Mnm E全长基因回补株（cS8△Mnm E），并经PCR和测序鉴定。将上述两株菌分别在无抗性培养基中传10代每代均经相应PCR鉴定其遗传稳定性。采用q RT-PCR检测Mnm E基因突变对其上下游基因转录水平的影响。结果显示，突变株S8△Mnm E和回补株cS8△Mnm E均正确构建，且遗传稳定性均较好；q RT-PCR结果显示，S8△Mnm E株Mnm E上下游基因的转录水平均与亲本株无明显差异。通过检测不同时间点的OD600nm值并绘制生长曲线分析上述两种菌与亲本株分别在20种不同氨基酸单独缺失培养基中的生长特性；通过微量结晶紫染色法，测定3株菌在不同培养时间生物被膜（BF）的形成能力；通过测定3株菌在不同浓度H2O2中的增殖能力，分析3株菌的体外抗氧化应激能力。结果显示，S8、S8△Mnm E及c S8△Mnm E株在含全部20种氨基酸的化学合成培养基中的增殖速度基本一致，但在谷氨酰胺（Gln）、色氨酸（Trp）、谷氨酸（Glu）缺失时，S8△Mnm E株的增殖水平明显低于亲本株，而在甲硫氨酸（Met）、赖氨酸（Lys）缺失时S8△Mnm E株的生长速度快于亲本株。培养36 h、48 h时各菌株BF的形成能力基本无差异，但在培养72 h时，S8△Mnm E株BF的形成能力约为亲本株的1.5倍（P＜0.001）；与S8株相比，S8△Mnm E株经不同浓度H2O2处理后的活菌数均明显降低，且降低水平与H2O2的浓度成正比。而回补株则基本恢复了亲本株的生长特性。通过对大蜡螟的致病性试验测定S8与S8△Mnm E的半数致死量(LD₅₀)，结果显示S8的LD50为3.16×108cfu/mL,S8△Mnm E株的LD50为1.58×10~9cfu/mL，前者比后者升高约5倍。本研究结果首次表明Mnm E可参与APP BF的形成，并影响其体外抗氧化应激能力及调控APP生长，降低APP的致病性。为进一步阐明APP的致病机制提供参考依据。