文献类型: 中文期刊
作者: 周燕霞 1 ; 胡韦维 1 ; 张虹洋 1 ; 邹琳 1 ; 张鹏辉 1 ;
作者机构: 1.重庆医科大学附属儿童医院临检中心//儿童发育疾病教育部重点实验室//儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地//认知发育与学习记忆障碍转化医学重庆市重点实验室
关键词: G6PD;CRISPR/Cas9;基因敲除;HEK293T细胞
期刊名称: 南方医科大学学报
ISSN: 1673-4254
年卷期: 2019 年 03 期
页码: 320-327
收录情况: 北大核心 ; CSCD
摘要: 目的利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因常见突变位点——c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T细胞,为后期研究其基因修复提供可靠的细胞模型。方法针对G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点靶向设计4对向导RNA(sgRNA),构建表达Cas9-sgRNA的外源PX458质粒,将其转染至HEK293T细胞内,通过流式细胞术分选表达GFP荧光蛋白的细胞进行培养,利用T7核酸内切酶1(T7E1)酶切验证CRISPR/Cas9的剪切效率,有限稀释法筛选单克隆细胞,测序鉴定并检测G6PD mRNA、蛋白表达和细胞功能的改变。结果成功构建基于G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的Cas9-sgRNA外源PX458质粒,T7E1酶切检测四对sgRNA的编辑效率分别为6.74%、12.36%、12.54%、2.94%。测序鉴定敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的细胞株构建成功,细胞G6PDmRNA、蛋白表达和G6PD酶活性降低,细胞增殖能力下降,维生素K3诱导细胞死亡增加。结论本研究成功构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞模型,为后期研究基因的修复奠定了基础。
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