文献类型： 中文期刊

作者： 曹鹏 ¹ ; 许建建 ¹ ; 李楚欣 ¹ ; 王新亮 ¹ ; 王春庆 ¹ ; 宋晨虎 ¹ ; 宋震 ¹ ;

作者机构： 1.西南大学柑桔研究所

关键词： 柑橘黄化花叶病毒;实时荧光定量PCR;时空分布

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2023 年 018 期

页码： 3574-3584

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【背景】柑橘黄化花叶病毒（citrus yellow mosaic virus,CYMV）是首先发现于印度并对其柑橘产业造成严重危害的一种杆状DNA病毒。目前，CYMV已被美国、日本、新西兰、欧洲和地中海地区列入检疫性有害生物名单，具有传入我国的潜在风险。【目的】建立CYMV的实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,q PCR）检测体系；筛选CYMV敏感柑橘品种；明确CYMV在寄主植株中的时空分布规律，为该病毒的监控提供技术支持。【方法】根据NCBI中CYMV外壳蛋白（coat protein,CP）基因保守序列，利用软件Primer Premier 5设计q PCR检测引物8对，通过常规PCR筛选扩增效果好、特异性强的引物。通过对引物浓度、退火温度等反应条件优化，建立CYMV的q PCR检测体系，并进一步通过对不同柑橘病原的检测评价所建体系的特异性；以梯度稀释的1.98×10~9—1.98 copies/μL的质粒标准品平行进行常规PCR及q PCR检测，评价所建方法的灵敏度；随机采集田间柑橘样品，平行进行常规PCR及q PCR检测，评价所建方法的适用性。将CYMV接种到玉环柚（Citrus grandis）、强德勒柚（C.grandis）、22号枳（Poncirus trifoliata）等15个柑橘品种，进行症状观察和分子检测以筛选敏感指示植物。在接种后不同时间，分别自MV甜橙（C.sinensis）植株不同组织部位取样，以柑橘生长因子1α基因为内参基因，利用所建体系进行q PCR检测，从而明确CYMV在寄主植株中的时空分布规律。【结果】建立了CYMV的q PCR检测体系，其最佳引物为CYMV-q F7/R7，最佳引物浓度为200 nmol·L^-1，最佳退火温度为63℃。该检测体系的特异性强，检测灵敏度是常规PCR的1 000倍。对来自不同地区的660个田间柑橘样品的检测结果表明，q PCR检测与常规PCR检测结果一致，除阳性对照外均未检测到CYMV阳性植株。不同柑橘品种接种试验结果表明，15个柑橘品种中，玉环柚和强德勒柚最早表现出强烈的黄化花叶典型侵染症状，可以作为敏感指示植物。q PCR检测结果表明，老叶中的CYMV滴度最高，老皮和根病毒滴度较高，嫩皮中的滴度较低。CYMV在植株中的相对含量，7—9月最高，此后逐月下降，并在次年1月达到最低值，从次年2月开始，CYMV的相对含量开始上升，与环境温度变化趋势一致。【结论】建立了特异性强、灵敏度高的CYMV实时荧光定量PCR检测方法，利用该方法明确了CYMV在寄主植株中的时空分布规律。此外，玉环柚和强德勒柚可作为CYMV敏感指示植物。