文献类型： 中文期刊

作者： 宾羽 ¹ ; 张琦 ¹ ; 王春庆 ¹ ; 赵晓春 ¹ ; 宋震 ¹ ; 周常勇 ¹ ;

作者机构： 1.西南大学柑桔研究所

关键词： 柑橘黄化脉明病毒;尤力克柠檬;酵母双杂交;外壳蛋白;寄主因子

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2023 年 010 期

页码： 1881-1892

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】柑橘黄化脉明病毒（citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）是威胁我国柑橘产业稳定发展的主要病毒，但其在柑橘上的侵染和致病机制尚不清楚。本文以CYVCV的外壳蛋白（coat protein,CP）为诱饵筛选尤力克柠檬（Citrus limon Burm.f.）c DNA文库，利用生物信息学方法分析与其互作的寄主因子在病毒侵染和致病过程中可能发挥的作用。【方法】Trizol法提取尤力克柠檬叶片总RNA，用SMART法反转录合成First-Strand c DNA，以其为模板通过Long-Distance PCR获得ds c DNA，均一化处理后与线性化p GADT7质粒重组链接构建尤力克柠檬初级c DNA文库，重组质粒转化大肠杆菌DH10B获得尤力克柠檬大肠杆菌c DNA文库并对文库质量进行鉴定；PCR扩增CYVCV的CP序列并构建到载体p GBKT7上，鉴定诱饵质粒对酵母细胞的毒性以及CP蛋白对酵母报告基因的自激活性。将尤力克柠檬c DNA文库质粒转化含有诱饵质粒p GBKT7-CP的Y2H Gold酵母菌株，共转化子依次涂布SD/-Leu-Trp、SD/-Leu-Trp-His/X-α-Gal和SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal平板，最终筛选蓝色且长势较好的阳性菌落，提取酵母质粒并测序比对获得候选基因，利用Uniprot在线网站的gene ontology（GO）注释候选基因，分析候选互作蛋白的生物学功能。根据分析结果，选取可能参与寄主抗病或症状发展的候选因子，扩增其CDS全长序列并构建到靶标载体p GADT7后分别与p GBKT7-CP共转化酵母细胞进行点对点酵母双杂交互作验证。【结果】尤力克柠檬大肠杆菌c DNA文库滴度为1.02×10⁸ cfu/m L，库容符合试验标准；成功构建酵母双杂交诱饵载体p GBKT7-CP，该载体没有自激活性且对酵母菌没有毒性；在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-Gal平板上筛选得到41个酵母阳性克隆，经序列相似性比对，去除重复，共筛得32个候选寄主因子；GO通路注释结果表明这些寄主因子参与多个叶绿体相关的生物过程，包括碳水化合物代谢、光合作用、光刺激反应、代谢分解和生物合成等过程；这32个寄主因子的分子功能多样，包括催化活性、水解酶活性、转移酶活性、蛋白质结合、转录因子活性和翻译因子活性等，其细胞组分涉及叶绿体、类囊体、膜、细胞质、细胞核和高尔基体等。从候选寄主因子中选取14个重要的蛋白与CP的一对一酵母双杂交验证结果表明，CP与这14个蛋白均发生互作。【结论】成功构建了尤力克柠檬c DNA文库，筛选出32个与CYVCV CP互作的尤力克柠檬寄主因子，分析重要的寄主蛋白功能，推测CYVCV CP通过与光系统Ⅱ放氧强化复合物组分蛋白（Psb P）、光系统I叶绿素结合蛋白（Lhca3）和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基（Rbc S）等多个叶绿体相关蛋白的互作，影响光系统稳定、类囊体结构和叶绿素合成，从而导致光合作用降低以及叶绿体形态和功能受损，酵母点对点验证了CP与这些叶绿体相关因子的互作，这为揭示CYVCV CP参与病毒致病的分子机制提供了理论依据。