文献类型： 中文期刊

作者： 马志敏 ¹ ; 许建建 ¹ ; 段玉 ¹ ; 王春庆 ¹ ; 苏越 ¹ ; 张琦 ¹ ; 宾羽 ¹ ; 周常勇 ¹ ; 宋震 ¹ ;

作者机构： 1.西南大学柑桔研究所

关键词： 柑橘;柑橘黄化脉明病毒;RT-RPA;侧向流层析试纸条;快速检测

期刊名称： 中国农业科学

ISSN：

年卷期： 2021 年 015 期

页码： 3241-3249

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】利用逆转录重组酶聚合酶扩增技术（reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA）,结合侧向流层析（lateral flow dipstick,LFD）试纸条,建立一种快速简便、特异、灵敏、裸眼可视的柑橘黄化脉明病毒（citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）检测新方法。【方法】根据CYVCV外壳蛋白基因的保守序列设计5对引物,通过样品检测筛选出扩增效果好、特异性强的引物对。将选出的引物进行标记物修饰,并设计对应的特异性探针,分别设置6个反应时间梯度（5、10、20、30、40、50 min）和8个反应温度梯度（37、38、39、40、41、42、43、44℃）,对RT-RPA反应条件进行优化,建立CYVCV的RT-RPA检测体系。分别以仅感染了CYVCV、柑橘叶斑驳病毒（citrus leaf blotch virus,CLBV）、柑橘衰退病毒（citrus tristeza virus,CTV）、柑橘碎叶病毒（citrus tatter leaf virus,CTLV）、柑橘裂皮病类病毒（citrus exocortis viroid,CEVd）、柑橘鳞皮病毒（citrus psorosis virus,CPV）、温州蜜柑萎缩病毒（satsuma dwarf virus,SDV）、柑橘黄龙病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas）和柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc）柑橘材料的总核酸为模板,采用所筛选的最佳引物、探针和反应条件进行检测,评价所建立RT-RPA检测体系的特异性。将感染了CYVCV的柑橘总RNA样品进行10倍梯度稀释,以原液和10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀释液作为模板,平行进行RT-PCR及RT-RPA的检测,评价所建立检测方法的灵敏度。随机采集来自田间9个不同品种柑橘的叶片,同时进行RT-RPA和RT-PCR检测,检验所建立RT-RPA检测方法的适用性。【结果】建立了CYVCV的RT-RPA检测体系:最佳引物为CY1-F/R,对应探针为CY1-Probe（47 bp）,最佳反应条件为39℃,30 min,特异扩增目的片段为177 bp,检测结果可通过侧向流层析试纸条直接判读。特异性检测结果显示,利用该检测体系仅对感染了CYVCV的样品检测结果为阳性,其余均为阴性;灵敏度检测结果显示,RT-RPA与RT-PCR方法均最低可检测到10^-4稀释液,两种方法检测灵敏度相当。随机采集的45株田间柑橘样品中,RT-PCR与RT-RPA均检测出37个阳性样品,检出率均为82.2%,表明该方法检测效果稳定可靠。【结论】建立了CYVCV的RT-RPA检测方法,该检测方法操作简单、反应快速,结果裸眼可视,适用于基层条件不足的实验室或者植检站现场快速检测。