文献类型： 中文期刊

作者： 蒋琪琪 ¹ ; 许建建 ¹ ; 苏越 ¹ ; 张琦 ¹ ; 曹鹏 ¹ ; 宋晨虎 ¹ ; 李中安 ¹ ; 宋震 ¹ ;

作者机构： 1.西南大学柑桔研究所

关键词： 柑橘黄化花叶病毒;侵染性克隆;农杆菌介导接种;突变体

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2022 年 024 期

页码： 4840-4850

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】构建柑橘黄化花叶病毒（citrus yellow mosaic virus,CYMV）侵染性克隆，为深入研究其分子特性及致病机理打下基础。【方法】利用In-Fusion同源重组技术将分段扩增的CYMV基因组序列与三元表达载体pCY重组连接，构建该病毒1.4倍基因组全长DNA克隆并开展序列分析。将所获克隆通过农杆菌介导接种尤力克柠檬实生苗，通过分子检测、症状和病毒粒子观察及再嫁接实验鉴定其侵染性。利用所获侵染性克隆接种不同的柑橘品种及草本植物，通过RT-PCR检测确定侵染率，观察不同柑橘品种受侵染后的症状差异。基于侵染性克隆构建ORFⅠ和ORFⅡ分别替换为绿色荧光蛋白基因（green fluorescent protein,gfp）的突变体，分析突变对病毒侵染性的影响。【结果】利用In-Fusion同源重组技术获得CYMV 1.4倍基因组全长DNA克隆7个。其中，CYMV-3与已登录GenBank的9个CYMV分离株基因组相应核苷酸序列一致性为90%—100%，与分离株CYMV-SO（AF347695）同源性最高并在遗传进化树上聚为一簇。侵染性鉴定结果表明，CYMV-3接种的14株尤力克柠檬植株中有4株呈RT-PCR阳性，并观察到点状褪绿症状；提取侵染植株系统新叶DNA,PCR扩增获得预期的覆盖CYMV基因组全长的特异性片段；以CYMV-3侵染显症植株为毒源嫁接接种粗柠檬实生苗，通过RT-PCR在90 dpi可检测到CYMV特异性条带；取CYMV-3侵染显症植株的新叶进行固定切片并电镜观察，可见大小约130 nm×30 nm的杆状病毒粒子，说明CYMV-3为CYMV侵染性克隆。将CYMV-3通过农杆菌介导真空浸润接种10个柑橘品种，注射接种5个柑橘品种并进行RT-PCR检测，结果显示前者侵染率为11.11%—100.00%，后者侵染率为63.16%—90.00%，部分柑橘品种出现黄化、花叶、斑块状黄化等CYMV侵染症状。通过农杆菌介导注射接种本氏烟、玉米、豇豆和高粱，结果显示仅高粱检测到RT-PCR阳性植株，且系统叶片沿叶脉周边出现条状褪绿带，表明CYMV可以侵染高粱。构建了CYMV-3 ORFⅠ和ORFⅡ分别替换为gfp的突变体，通过农杆菌介导注射接种粗柠檬，RT-PCR检测结果均为阴性，且无侵染症状。【结论】成功构建了CYMV的侵染性克隆，通过农杆菌介导注射可高效接种柑橘植株，侵染症状在不同品种上具有差异。