文献类型： 中文期刊

作者： 丁仕豪 ¹ ; 周薇 ¹ ; 许秋 ¹ ; 张卓 ¹ ; 陆瑶 ¹ ; 刘思国 ¹ ; 于申业 ¹ ;

作者机构： 1.兽医生物技术国家重点实验室

关键词： 副结核分枝杆菌;重组蛋白rMAP62-54c;表面展示;免疫效果

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2020 年 42 卷 010 期

页码： 1032-1038

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 为开发高效表面展示副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosis,MAP)抗原的大肠杆菌活载体疫苗,本研究将融合的目的基因map0862-2154c克隆于pET-INP载体,构建了重组质粒pET-INP-6254c.将该重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达后经western blot及流式细胞术等技术检测目的蛋白的表达及定位,western blot分析结果显示,诱导的全菌以及超声后的上清和沉淀在75 ku处均出现目的条带;流式细胞术结果显示,重组蛋白rMAP62-54c能够表达并展示到细胞表面.将110只BABL/c小鼠分为4组:INP-28a/BL21对照组(n=30)和INP-rMAP62-54c/BL21疫苗组(n=30)(均以5× 105 cfu/只腹腔注射免疫小鼠3次),PBS对照组(n=30)(注射等体积PBS),三免后以5×105 cfu/只MAP标准株K-10感染上述3组小鼠;空白组(n=20)(不做处理).然后通过ELISA、流式细胞术等方法定期检测各组小鼠血清IgG抗体水平、脾脏CD4+ T/CD8+T细胞含量及比值、细胞因子IFN-γ、IL-17A及IL-10水平和小鼠增重率及其肝脏、脾脏和结肠病理损伤评价免疫效果.结果 显示,重组菌INP-rMAP62-54c/BL21免疫组小鼠脾脏CD4+ T/CD8+T细胞比值自免疫2周起即显著高于两个对照组(p<0.01);抗体检测结果显示,自小鼠免疫4周起,重组菌INP-rMAP62-54c/BL21诱导小鼠产生了高水平的特异性血清IgG抗体,与两个对照组相比差异极显著(p<0.001);细胞因子检测结果显示,攻毒后疫苗组小鼠血清中IFN-γ、 IL-17与两个对照组相比差异极显著(p<0.01);攻毒14周疫苗组小鼠血清中IL-10分泌量明显下降,与两个对照组相比差异显著(p<0.05);随着攻毒时间的延长INP-rMAP62-54c/BL21疫苗组小鼠体质量保持增加趋势,而两个对照组小鼠体质量一直下降;病理组织学结果显示,疫苗组小鼠与空白组小鼠相比脏器未出现明显病变.本研究首次构建了INP-rMAP62-54c/BL21表面展示大肠杆菌,其能显著增强小鼠对MAP的抵抗能力,并且能刺激小鼠机体产生较高的细胞和体液免疫水平,该结果为新型副结核疫苗的开发奠定了基础.