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层粘连蛋白受体作为猪瘟病毒吸附受体的鉴定

文献类型： 学位论文

年份： 2015

导师姓名： 仇华吉

作者： 陈佳宁

出版单位： 中国农业科学院

关键词： 猪瘟病毒;细胞受体;层粘连蛋白受体;硫酸乙酰肝素

研究方向： 预防兽医学

摘要： 病毒是结构简单的微生物,无完整的代谢酶系统,需要借助宿主细胞合成自身物质从而完成自身生命周期。病毒囊膜蛋白与宿主细胞表面成分——细胞受体的相互结合则是一切病毒进入宿主细胞的起始,并决定了病毒感染的种属范围和组织嗜性。尤为重要的是,病毒囊膜蛋白与相应细胞受体的结合位点往往成为开发抗病毒药物的重要靶标。因此,针对病毒受体的研究具有重要的科研和应用价值。猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的烈性传染病。该病对养猪业危害极大,在多个国家均有流行,具有重要的经济意义。近年来,随着对CSFV研究的不断深入,研究者发现了大量与该病毒相互作用的宿主蛋白,并探讨了其机理,但针对CSFV细胞受体的研究尚属空白。迄今,仅有硫酸乙酰肝素(Heparin Sulfate,HS)被鉴定为CSFV的吸附受体。该分子亦广泛分布于CSFV非易感细胞表面,因此,我们推测CSFV一定存在其它尚未发现的细胞受体,并采取一系列方法筛选细胞受体。本研究中,我们利用针对大量猪源膜蛋白基因的小分子干扰RNA来筛选可能参与CSFV感染的膜蛋白。该筛选发现了多个CSFV潜在受体分子。其中,层粘连蛋白受体(Laminin receptor,Lam R)已被鉴定为多种病原体的细胞受体,我们选择该蛋白进行后续研究。激光共聚焦分析显示,该蛋白与CSFV在细胞膜高度共定位。免疫共沉淀试验说明该蛋白与CSFV囊膜糖蛋白Erns存在特异性相互作用。一系列抑制试验显示,抗Lam R蛋白抗体、可溶性Lam R和Laminin蛋白均可显著抑制CSFV的复制,并且该抑制效果呈现剂量依赖性。我们以表达Lam R的慢病毒感染PK-15细胞,构建稳定表达Lam R的细胞系。CSFV在该细胞系的复制水平显著高于对照细胞系。我们利用吸附试验说明Lam R蛋白在CSFV吸附阶段发挥功能,Lam R过表达细胞系较对照细胞系吸附病毒粒子数显著增多。我们进一步探讨了HS与Lam R的关系,结果显示,Lam R蛋白和HS互相协同,帮助病毒吸附。该现象在SK6细胞尤为明显。但Lam R的表达与CSFV的组织嗜性并无明显相关性,而其被沉默后也不影响同属黄病毒科瘟病毒属的BVDV的复制。综上所述,我们利用si RNA文库对重要的猪源膜蛋白基因进行筛选,并通过一系列抑制试验、吸附试验确定Lam R为CSFV的又一吸附受体,该分子与已知受体HS相互协同,帮助CSFV感染。

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