文献类型： 中文期刊

作者： 魏小乐 ¹ ; 王晓霞 ² ; 贾怀杰 ² ; 景志忠 ² ; 王永祥 ² ; 谭继英 ³ ;

作者机构： 1.兰州大学基础医学院免疫学研究所;兰州大学公共卫生学院营养与食品卫生学研究所;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室

2.;兰州大学基础医学院免疫学研究所;兰州大学公共卫生学院营养与食品卫生学研究所;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室

3.;兰州大学基础医学院免疫学研究所;兰州大学公共卫生学院营养与食品卫生学研究所;中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室;

关键词： APOBEC3A;HIV-1启动子;DNA去甲基化;真核表达载体

期刊名称： 兰州大学学报(医学版)

ISSN： 1000-2812

年卷期： 2018 年 03 期

页码： 8-15

摘要： 目的真核细胞内,DNA甲基化调控在转座子沉默、基因表达调控、甚至病毒感染过程中起关键作用,其中HIV-1启动子的甲基化修饰在病毒潜伏感染中扮演重要角色。为明确载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3A(APOBEC3A,A3A)对HIV-1启动子5'LTR上CpG岛甲基化程度的调节作用,本研究构建并筛选出A3A异构体A3A Isotype a(A3Aa)和A3A Isotype b(A3A-b)高表达真核载体,分析其去甲基化功能。方法从THP-1细胞mRNA中扩增得到A3A-a和A3A-b的c DNA,分别克隆至真核表达载体pASIB-HA和pCAGGS-HA。转染HEK-293T细胞,蛋白印迹法检测A3A-a和A3A-b的蛋白表达,并筛选出A3A-a和A3A-b的高表达载体。接着将A3A-a和A3A-b高表达载体与实验室构建并修饰的HIV-1启动子甲基化载体p-me LTR-EGFP共转染HEK-293T,检测指示蛋白EGFP在细胞水平中的表达,评价A3A-a和A3A-b的去甲基化调节作用。结果 PCR结果、酶切鉴定和测序结果均表明A3A真核表达载体pASIB-HA-A3A1-a、pCAGGS-HA-A3A2-a、pASIB-HA-A3A1-b、pCAGGS-HA-A3A2-b构建成功。经过筛选,pCAGGS-HA-A3A2-a和pCAGGS-HA-A3A2-b中A3A蛋白表达量最高,并用于后续实验。甲基化载体共转染实验显示,相较于对照A3G转染组,A3A-a和A3A-b组中EGFP的表达量明显上调。结论本研究在细胞水平上证实A3A分子Isotype a和Isotype b均可识别DNA中5-甲基化胞嘧啶,催化HIV-1启动子CpG岛去甲基化,为后续研究A3A对HIV潜伏感染调控奠定了基础。