文献类型： 中文期刊
作者机构： 1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室禽呼吸道传染病创新团队
关键词： 鸡传染性喉气管炎病毒;gG蛋白;单克隆抗体;间接竞争ELISA
期刊名称： 中国预防兽医学报
ISSN： 1008-0589
年卷期： 2023 年 45 卷 007 期
页码： 704-709,728
收录情况： 北大核心 ; CSCD
摘要： 鸡传染性喉气管炎是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病.为建立检测该病毒gG蛋白的间接竞争ELISA方法,本研究以原核系统表达ILTV gG蛋白,并采用切胶纯化该重组gG蛋白(rgG)后经western blot检测纯化的rgG(P-rgG)与本研究室制备的gG蛋白单克隆抗体(MAb)3C8的反应原性.将MAb 3C8采用Protein G亲和层析柱纯化后与HRP偶联(HRP-3C8),利用间接ELISA法测定纯化HRP-3C8的效价.结果显示,P-rgG与MAb 3C8发生了特异性反应,在30 ku处出现特异性条带.纯化的HRP-3C8效价达1∶51 200.以P-rgG作为包被抗原,以纯化的HRP-3C8作为检测抗体,通过对各反应条件优化后初步建立了ILTV gG蛋白间接竞争ELISA(ic-ELISA)检测方法.条件优化结果显示,P-rgG包被量为12.5 ng/孔,HRP-3C8抗体稀释度为1∶10 000,将待检样品与HRP-3C8抗体在37 ℃孵育40 min后加入ELISA板再反应20 min,TMB底物反应10 min.将待检样品的抑制率(PI)≥ 31.08%判为阳性;采用该方法分别检测ILTV、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡痘病毒(FPV),通过计算PI,评估该方法的特异性;按照Reed-Muench法测定ILTV K317株的鸡胚半数感染量(EID50),再将该病毒2倍倍比稀释(1∶10~1∶2 560)后,以该ic-ELISA方法检测,评估该方法的敏感性;利用同批次和不同批次P-rgG分别包被ELISA板,采用该ic-ELISA方法检测ILTV阳性及阴性样品,评估该方法的重复性.结果显示,该方法除了能检测ILTV外,其余相关病毒均为阴性结果;将ILTV稀释至1:320时检测结果仍为阳性,相当于75 EID50/0.1 mL;批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%.利用该方法及荧光定量PCR(qPCR)分别检测50份临床ILTV、IBV和FPV感染鸡的口咽拭子和喉头组织、10份ILTV活疫苗,该方法检测结果显示,阳性检测率为73.3%(44/60),阴性率为26.7%(16/60).qPCR的检测结果显示,阳性检测率为81.7%(49/60),阴性率为18.3%(11/60),二者的阴、阳性符合率分别为90.9%和87.8%,总符合率为88.3%.本研究建立的ILTV gG蛋白ic-ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于检测实验室和临床ILTV感染的不同样品,为ILTV及其疫苗的检测提供了新的技术手段.
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