文献类型： 中文期刊

作者： 韩雪 ¹ ; 张阿娜 ² ; 王海燕 ³ ; 辛凤姣 ¹ ; 谷天一 ¹ ; 王钰璐 ¹ ;

作者机构： 1.中国农业科学院农产品加工研究所

2.山西农业大学食品学院

3.北京挑战生物技术有限公司

关键词： 木聚糖酶;柔性区域;热稳定性;毕赤酵母;理性设计

期刊名称： 生物技术通报

ISSN： 1002-5464

年卷期： 2024 年 40 卷 010 期

页码： 305-314

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： [目的]瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum GH11 家族木聚糖酶CDBFV在饲料、食品等领域具有良好应用前景,提高其热稳定性对其生产应用十分重要.[方法]使用分子动力学模拟、机器学习等策略设计潜在CDBFV热稳定性突变体,在大肠杆菌和毕赤酵母中进行异源表达纯化,测定最适反应条件、比酶活和 85℃孵育 3 min后相对剩余活力,通过结构分析明确热稳定性提高机制.[结果]位于CDBFV N端基序 36GNNS39 具有较高柔性,对其改造设计的单突变体N37P和N38V在 85℃孵育 3 min后,相对活力分别降低至 70.3%和 55.1%,较野生型(48.7%)提升了 21.6%和 6.5%;进而,在相对活力提升显著的N37P基础上叠加已报道优势突变体N88G,构建双突变体N37P/N88G,其相对活力达到了 73.4%,较野生型提高了 24.7%;此外,将N37P/N88G在毕赤酵母中进行了分泌表达,在 85℃处理 3 min后,相对活力达到了 88.8%;结构分析表明,N37P突变的引入使得CDBFV形成了新的氢键相互作用,降低活性位点附近柔性,并干预了糖基化形成,进而提高了热稳定性.[结论]成功得到了高耐热双突变体N37P/N88G,为提高GH11 家族木聚糖酶的热稳定性改造提供了新的思路和方法,有望推动CDBFV在饲料工业等高温环境下的广泛应用.