文献类型： 中文期刊

作者： 史家宝 ¹ ; 蒙靓 ¹ ; 肖培宇 ¹ ; 范峻豪 ¹ ; 安同庆 ¹ ; 王海伟 ¹ ; 于力 ¹ ;

作者机构： 1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室

关键词： 塞内卡病毒;Strep-tag II;感染性克隆;抗原纯化

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2024 年 002 期

页码： 140-146

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 为构建表达Strep-tag II的重组塞内卡病毒（SVA），本研究在感染性cDNA克隆p SVA-I212V/S460L的基础上，采用重叠延伸PCR扩增Strep-tag II并采用无缝克隆法将其插入SVA VP1基因C端，构建感染性cDNA克隆，命名为p SVA-Strep，并采用双酶切和测序鉴定正确后，将p SVA-Strep转染BHK-21细胞拯救重组病毒，收集病变细胞上清，并将含有病毒的细胞上清和野生型SVA（SVA-WT）分别感染BHK-21细胞，以未感染病毒的BHK-21细胞作为阴性对照，感染后24 h分别以鼠源SVA VP2蛋白单克隆抗体（MAb） 5D10 （1∶1 000）、鼠源Strep-tag II MAb （1∶2 000）作为一抗，以FITC标记的山羊抗小鼠Ig G （1∶2 000）为二抗，采用间接免疫荧光试验（IFA）对重组病毒鉴定。IFA结果显示，以鼠源SVA VP2蛋白MAb 5D10为一抗，SVA-WT和重组病毒感染的细胞均出现绿色荧光，以Strep-tag II MAb作为一抗时，仅有重组病毒感染的细胞出现绿色荧光，经SVA-WT感染的BHK-21细胞及阴性对照细胞均无绿色荧光，表明拯救了Strep-tag II标记的重组病毒，并将其命名为r SVA-Strep。将r SVA-Strep在BHK-21细胞中连续传10代，每隔2代采用引物VP1-F/R经PCR鉴定并对第10代重组病毒的VP1基因测序以鉴定r SVA-Strep的遗传稳定性。结果显示，每隔两代的重组病毒经PCR扩增后均出现约780 bp的目的条带，第10代重组病毒扩增的VP1基因测序结果显示Strep-tag II基因仍在重组病毒中，且无基因突变，表明r SVA-Strep的遗传稳定性较强；将SVA-WT和r SVA-Strep分别以MOI 0.01感染BHK-21细胞，在感染后4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h和72 h收获病毒测定病毒滴度并绘制生长曲线，结果显示在病毒感染36 h内r SVA-Strep和SVA-WT生长动力学基本一致，表明Strep-tag II的引入在病毒感染36 h内对SVA的复制基本无影响。采用0.2%甲醛充分灭活r SVA-Strep，并利用Strep-TactinRXT Purification纯化试剂盒纯化该灭活病毒，将r SVA-Strep灭活病毒上清加至Strep-Tactin亲和层析柱，分别用不同体积洗脱缓冲液依次洗脱病毒并通过western blot鉴定病毒的纯化效果。对纯化过程中不同洗脱液洗脱病毒的western blot结果显示，不同体积的洗脱液中E1、E2和E3均出现VP0和VP2两条带，且E1和E2的条带最明显，表明洗脱缓冲液的最佳洗脱体积约为2.2 CV；以上结果表明r SVA-Strep可通过Strep-Tactin亲和层析柱一步法纯化。本研究在SVA中插入Strep-tag II标签，为SVA灭活疫苗的快速纯化提供技术手段，也为其他病原的快速纯化方法的建立提供参考。