文献类型： 中文期刊

作者： 谢浩 ¹ ; 陈指龙 ² ; 彭翠婷 ² ; 潘颖婷 ² ; 齐霖 ² ; 赵玉兰 ² ; 闭英连 ³ ; 宋子仪 ¹ ; 唐中林 ² ;

作者机构： 1.广西大学动物科学技术学院广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室

2.中国农业科学院(深圳)农业基因组研究所

3.巴马原种香猪农牧实业有限公司

关键词： CRISPR/Cas9;MSTN;pAPN;CD163;多基因编辑;PEF;胚胎

期刊名称： 中国农业科技导报

ISSN： 1008-0864

年卷期： 2025 年 27 卷 011 期

页码： 226-239

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： CRISPR/Cas9作为一款强大的基因编辑工具,在猪的遗传改良中已经广泛应用.然而,单一基因的编辑无法满足多性状的同步改良.为利用CRISPR/Cas9基因编辑体系构建MSTN、pAPN和CD163多基因编辑猪胚胎成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEF)并制备胚胎,首先,根据猪CD163、MSTN和pAPN蛋白功能结构域,选定MSTN外显子1、CD163外显子7及pAPN外显子2作为打靶区域,各设计2对sgRNAs,连接至骨架pX330载体,通过电转染至PEF,筛选每个基因编辑效率较高的sgRNA;然后,利用同源重组法将CD163、MSTN、pAPN单个基因的sgRNA表达盒组装成一体化串联表达系统,转化至Fast-T1感受态细胞并进行Sanger测序鉴定;最后,利用电转染方式将3基因敲除载体转染至PEF,用2.5 μg·mL-1的嘌呤霉素进行药筛,挑选单克隆细胞,PCR扩增后进行Sanger测序,鉴定单克隆细胞MSTN、CD163、pAPN基因的打靶序列.结果显示,CD163、MSTN、pAPN基因的sgRNA1编辑效率高于sgRNA2,因此选择较高效率sgRNA1用于构建一体化质粒.质粒测序显示,3个基因的sgRNA表达盒成功连接到骨架pX330载体上.挑取45株转染3基因编辑质粒的单克隆细胞,测序结果显示,MSTN、pAPN、CD163基因的突变率分别为62%、26%、11%,其中有4株细胞实现了3个基因同时编辑(效率为8.9%).进一步用编辑细胞进行体细胞核移植生产胚胎,与未编辑细胞生产的胚胎在体细胞融合率、胚胎卵裂率和囊胚率上均无显著差异;测序结果显示,胚胎水平的打靶结果与体细胞一致.综上,利用CRISPR/Cas9技术制备猪MSTN、pAPN、CD163基因同时编辑的PEF和胚胎,为多基因编辑克隆猪的制备奠定基础和提供参考.