文献类型： 学位论文

年份： 2016

导师姓名： 张增艳

作者： 祝秀亮

出版单位： 中国农业科学院

关键词： 小麦;纹枯病;NB-LRR;蛋白激酶;活性氧

研究方向： 生物化学与分子生物学

摘要： 近年来,由于气候变暖、耕作制度和种植密度的改变,由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起的小麦纹枯病(wheat sharp eyespot),已发展为我国主要的病害,连续十多年发病面积超过一亿亩,损失严重。生产上抗纹枯病小麦品种匮乏,因此分离克隆抗纹枯病相关基因,研究其功能和作用机制,为抗纹枯病小麦育种提供基因和理论支撑,具有重要意义。NB-LRR类蛋白和蛋白激酶是植物抗病反应中两种重要的蛋白。本研究主要以纹枯病诱导的一个小麦NB-LRR类蛋白编码基因TaRCR1和一个蛋白激酶基因TaAGC1过表达的小麦和沉默表达的小麦为实验材料,研究了这两个基因在小麦抗纹枯病反应中功能和作用机制。TaRCR1编码NB-LRR类蛋白,参与小麦对纹枯病菌的防御反应。本研究继续对TaRCR1基因的分子生物学特性、抗病功能和作用机制进行了研究,主要结果如下:(1)TaRCR1受纹枯菌诱导表达,在接种纹枯菌7天后达到表达高峰,并且在根和茎中的表达量高于叶和穗中的表达量。(2)利用PEG介导GFP-TaRCR1融合蛋白在小麦原生质体中瞬时表达,进行亚细胞定位分析,结果显示TaRCR1分布于小麦的胞质和细胞核中。(3)利用PCR、q RT-PCR和Westernblot技术,对转Ta RCR1基因小麦T2-T4代植株进行转基因分子特征分析,结果表明,在6个转基因小麦株系中转入的TaRCR1能够遗传、转录和过量表达;对TaRCR1过表达转基因小麦株系和未转基因小麦扬麦16(受体)接种纹枯菌进行抗病性鉴定,结果表明TaRCR1基因的过表达提高了小麦对纹枯病的抗性。(4)应用大麦条纹花叶病毒(barley stripe mosaic virus,BSMV)诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术,摩擦接种BSMV:TaRCR1病毒,以沉默抗纹枯病小麦CI12633中TaRCR1基因的表达,再接种纹枯病菌进行抗病程度分析,结果说明TaRCR1基因表达量的降低,减弱了寄主小麦对纹枯病的抗性。(5)利用qRT-PCR分析14个防御相关基因在TaRCR1基因过表达小麦和受体扬麦16以及Ta RCR1基因表达沉默和对照小麦植株中的转录水平,结果表明Ta RCR1正向调控PR1、PR2、chitinase2和Ta PIE1的表达水平,这四个防御相关基因的表达还受纹枯菌的诱导。(6)H_2O_2和茉莉酸(jasmonic,JA)处理诱导Ta RCR1基因的表达水平,且H_2O_2预处理可以提高纹枯菌侵染对Ta RCR1基因的诱导表达水平;Ta RCR1所调控的PR1、PR2、chitinase2和Ta PIE1基因也受H_2O_2的诱导表达。(7)接种纹枯菌12 h后,Ta RCR1正向调控CAT1、POX2等活性氧(reactive oxygen species,ROS)清除相关基因的转录表达以及过氧化物酶(peroxidase,POD)的活性,负向调控ROS合成关键基因NOX的转录表达;DAB和NBT染色结果显示,Ta RCR1基因过量表达减弱了纹枯菌侵染引起的ROS积累;对转Ta RCR1基因小麦喷施POD合成的抑制剂Na N3降低了Ta RCR1过表达植株对纹枯病的抗性,说明小麦体内ROS的动态平衡对于Ta RCR1介导的纹枯病抗性非常重要,Ta RCR1通过调控ROS相关基因的表达维持ROS的动态平衡,进而正向调控小麦对纹枯病的抗性反应。(8)利用Anti-c-Myc Agarose纯化Ta RCR1过表达小麦体内总蛋白,用胰蛋白酶进行酶解处理后进行质谱分析,筛选到一个Ta RCR1互作蛋白Ta PP2Ac,酵母双杂交实验证明Ta RCR1与Ta PP2Ac相互作用;BSMV-VIGS实验证明,Ta PP2Ac的表达沉默提高了小麦对纹枯病的抗性;同时,Ta PP2Ac的q RT-PCR分析结果显示,Ta PP2Ac在Ta RCR1过表达小麦中的转录水平显著低于受体小麦,而在Ta RCR1基因表达沉默小麦植株中的表达水平显著高于对照植株中,推测Ta RCR1通过负调控Ta PP2Ac基因的表达水平提高小麦对纹枯病的抗性。本课题组前期研究表明,一个小麦蛋白激酶基因TaAGC1的过量表达可以显著增强转基因小麦对纹枯病的抗性反应,而该基因的表达沉默削弱了小麦对纹枯病的抗性。本文对TaAGC1抗纹枯病作用的机制进行了研究,取得以下结果:(1)TaAGC1响应H_2O_2的胁迫,H_2O_2处理后TaAGC1基因转录水平显著升高且在处理后3h达到表达高峰,这暗示TaAGC1基因可能参与H_2O_2信号转导路径。(2)DAB和NBT染色结果显示,纹枯菌的侵染诱导小麦植株产生大量的ROS(H_2O_2和O2-),TaAGC1基因过表达可以降低纹枯菌侵染引起的过量ROS的积累水平。qRT-PCR分析结果表明ROS消除相关基因POX2、CAT1和SOD3在Ta AGC1过表达株系中的表达量显著上调,而其在TaAGC1沉默表达植株中的表达量明显降低;ROS合成关键基因NOX的表达模式与以上3个基因的相反,即在TaAGC1过表达中表达量最低,在TaAGC1沉默表达植株中的表达量最高。(3)ns LTP1、defensin、chitinase2和PR10等防御标记基因的表达受纹枯菌诱导;TaAGC1正向调控nsLTP1和defensin的表达,而负向调控chitinase2和PR10的表达。由此可知,TaAGC1作为一个正向调节因子,通过调控ROS相关基因和防御基因的表达介导小麦对纹枯病的抗性反应。