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小麦抗纹枯病相关基因RS33的克隆及功能鉴定与TaPIE1基因的耐寒性分析

文献类型： 学位论文

年份： 2013

导师姓名： 张增艳

作者： 祝秀亮

出版单位： 中国农业科学院

关键词： 小麦;纹枯病;ERF转录因子;耐寒性;转基因小麦

摘要： 小麦纹枯病已成为我国小麦主要病害。选育和推广抗病小麦品种是控制该病害最经济、有效和安全的措施。然而，抗纹枯病小麦品种十分匮乏，因此分离克隆抗纹枯病相关基因，研究其功能，为抗纹枯病小麦育种提供基因和理论支撑，具有重要意义。本研究以抗纹枯病的小麦种质CI12633和感纹枯病的小麦品种温麦6号为实验材料，利用RNA测序数据分析结合(q)RT-PCR技术筛选差异表达基因，分离克隆出一个小麦抗纹枯病相关基因RS33，并分析了该基因的纹枯病抗性功能。主要结果如下：（1）通过RNA测序分析，筛选到1个受纹枯菌诱导表达的NBS-LRR类蛋白编码基因RS33。表达谱分析表明，RS33基因受纹枯菌诱导表达，且在抗纹枯病小麦山红麦和CI12633中的表达量显著高于在感纹枯病小麦温麦6号中的表达量。（2）从接种纹枯菌的CI12633的基因组DNA和cDNA中，利用RT-PCR和RACE方法分离到RS33基因的全长cDNA序列，利用巢式PCR方法克隆其基因组序列。基因组序列和cDNA序列分析表明，该基因包含有3个外显子和2个内含子，编码由945个氨基酸残基组成的NBS-LRR类蛋白。Conserved domainsequence分析显示，RS33蛋白具有NBS类抗病蛋白典型的结构域：由Kinase1a (P-loop)、Kinase-2（Walker B）、Kinase3a、疏水性区段（GLPL）和RNBS-D组成的NB-ARC，以及13个亮氨酸重复结构域（leucine-rich repeat, LRR）。系统进化分析显示，RS33与水稻Pikp-2和Pi1-6、大麦Mla1、Mla7和Mla10具有较近的亲缘关系。（3）明确了RS33基因应答纹枯菌和外源防卫激素诱导的表达特性。(q)RT-PCR分析表明，RS33基因的表达受纹枯菌的诱导；RS33基因受水杨酸诱导最为迅速（水杨酸处理1h，RS33表达达到最高峰），受脱落酸诱导较为滞后（脱落酸处理12h，RS33表达达到最高峰），而乙烯对其稍有抑制。（4）以小麦中国春缺体-四体系基因组DNA为模板，利用RS33基因的特异引物进行扩增，将RS33基因定位在3B染色体上。（5）RS33亚细胞定位分析。基因枪转化洋葱表皮细胞瞬时表达实验表明，RS33-GFP融合蛋白分布于细胞膜、胞质和细胞核。（6）利用基于大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默系统反向分析了RS33基因的功能。与对照植株相比，RS33基因表达抑制的CI12633植株表现出更明显的感病症状，说明RS33基因是小麦抗纹枯病反应中所需的基因。（7）RS33基因超表达的转基因小麦的分子与抗纹枯病鉴定，从正向验证RS33基因对纹枯病菌的防御功能。构建RS33基因高效表达载体pA25-RS33，利用基因枪介导法将其分别转入推广小麦品种科农199和扬麦16中，对T0-T1代PCR检测结果表明，获得了转RS33基因科农199阳性的T1代20株,转RS33基因扬麦16阳性的T1代27株；对转基因小麦T1代阳性植株中目标基因定量RT-PCR分析结果表明，RS33基因能够在转基因小麦植株中过量表达；与野生型科农199和扬麦16植株相比，RS33基因过量表达的转基因小麦植株中纹枯菌的侵入量显著降低，抗性提高，转RS33基因扬麦16和科农199植株纹枯病病级分别为1.07和1.20，而未转基因扬麦16和农科199的纹枯病病级分别为1.87和2.00。

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