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水稻类病斑突变体lm-ZH基因的图位克隆与功能分析

文献类型： 学位论文

年份： 2016

导师姓名： 曹立勇

作者： 刘群恩

出版单位： 中国农业科学院

关键词： 水稻;类病斑;OsCUL3a;OsNPR1;防卫反应

研究方向： 作物遗传育种

摘要： 本研究通过EMS诱变水稻品种中花11种子获得一个类病斑突变体,命名为:lm-ZH。随后对其开展表型分析、抗性鉴定、基因定位与克隆、基因功能分析等相关工作,获得的主要结果如下:1.在大田种植条件下,lm-ZH经播种移栽60天左右,其下部叶片叶尖处开始出现针点状红褐色坏死斑点。斑点数目和单个斑点面积随植株生长发育不断扩大,至抽穗后,逐渐发展至所有叶片、叶鞘以及颖壳表面。DAB染色结果表明:lm-ZH类病斑叶片中有大量H2O2积累。相较于ZH11,lm-ZH类病斑叶片对真菌几丁质和细菌鞭毛蛋白更为敏感,经其处理后,叶片中活性氧生产速率和积累峰值均明显高于ZH11。抗性鉴定结果显示:lm-ZH对稻瘟病菌和白叶枯病菌的抗性均有显著增强。防卫相关基因OsPR1a、OsPR1b、OsPR10、OsPAL1、OsAOS2及WRKY45在lmZH类病斑叶片中被激活显著上调表达。2.遗传分析结果表明:lm-ZH类病斑表型受一对隐性核基因控制。以lm-ZH为母本,南京11为父本杂交获得F2分离定位群体,通过图位克隆将lm-ZH类病斑基因精细定位于2号染色体长臂上位于标记ZN36和ZN9之间的123KB物理区间内。经测序比对后发现:第13个开放阅读框的第一内含子和第二外显子的衔接处发生了8个碱基缺失以及11个碱基替换的突变,致使mRNA加工过程中第二外显子上28个碱基被错误切除,最终导致蛋白翻译的提前终止。该基因编码一个CULLIN蛋白,在水稻体内组成型表达。进化分析结果显示:其与拟南芥CUL3a基因亲缘关系最近,遂命名为:OsCUL3a。来自ZH11的OsCUL3a基因组DNA片段能有效恢复lm-ZH类病斑表型。3.酵母双杂交、LCI及Bi-FC结果表明:OsCUL3a与OsRBX1a/b在体内均能互作。亚细胞定位结果显示:OsCUL3a和OsRBX1a/b在水稻原生质体的细胞质和细胞核中均有分布。随后通过LCI和Co-IP实验证明:OsCUL3a在体内与OsNPR1互作。在ZH11、lm-ZH及互补转基因材料pOsCUL3a的原生质体中瞬时表达OsNPR1后发现:OsCUL3a参与介导OsNPR1经由26S蛋白酶体被降解的过程。在lm-ZH背景下敲除OsNPR1后,oscul3a/osnpr1表现出细胞死亡执行障碍,类病斑表型得以恢复,叶片中防卫相关基因OsPR1a、OsPR1b及OsPR10的表达亦降低至正常水平。以上结果充分说明:lm-ZH类病斑表型由OsCUL3a功能缺失突变引起。OsCUL3a通过靶向降解OsNPR1而负调控水稻细胞死亡和防卫应激反应。

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