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禽偏肺病毒F蛋白介导膜融合及抑制β-干扰素机制研究

文献类型： 学位论文

年份： 2016

导师姓名： 王笑梅

作者： 贠炳岭

出版单位： 中国农业科学院

关键词： 禽偏肺病毒;融合蛋白;膜融合;病毒复制;β-干扰素

研究方向： 预防兽医学

摘要： 禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus,aMPV)属于副黏病毒科肺病毒亚科肺病毒属。aMPV感染火鸡引起火鸡鼻气管炎(Turkey rhinotracheitis,TRT),感染鸡引起肿头综合征(Swollen head syndrome,SHS),aMPV感染对养禽业造成经济损失和严重威胁。aMPV入侵宿主细胞需要病毒囊膜和细胞膜融合,这一过程是由融合蛋白(Fusion,F)介导的。然而,aMPV F蛋白介导膜融合的机制尚不清楚。另外,aMPV感染造成继发感染病毒或细菌,但这种免疫抑制效应尚不清楚。本研究旨在阐述aMPV F蛋白介导膜融合机制和aMPV免疫机理。aMPV和人偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)都属于肺病毒属。对于hMPV,胰酶和低pH诱导F蛋白介导膜融合呈现毒株依赖性。本研究中发现三个亚型的aMPV(aMPV/A,aMPV/B和aMPV/C)F蛋白介导细胞融合不需要胰酶。添加胰酶可以促进aMPV/C F蛋白融合活性。通过突变F蛋白100或101位点的氨基酸,发现胰酶调节aMPV F蛋白的融合活性是由100和101位点决定。另外,低pH环境不能促进aMPV/A和aMPV/B F蛋白融合活性,但能促进aMPV/C F蛋白融合活性。突变F蛋白294位点的氨基酸,发现低pH调节aMPV F蛋白的融合活性是由残基294G决定的。剖析aMPV F蛋白介导细胞融合所需基本条件有助于理解aMPV入侵机制。aMPV F蛋白裂解不依赖外源性的胰酶,意味着内源性的蛋白酶就可以裂解aMPV F蛋白,但是宿主中的裂解酶尚未确定。我们发现跨膜丝氨酸蛋白酶(Transmembrane serine protease 12,TMPRSS12)有助于裂解aMPV/B F蛋白。过表达TMPRSS12提高aMPV/B F蛋白的裂解程度、融合活性和aMPV/B复制。干扰TMPRSS12降低aMPV/B F蛋白的裂解程度、融合活性和aMPV/B复制。另外,我们发现aMPV/B F蛋白的100和101位点被TMPRSS12识别,并证实HDS(组氨酸,天冬氨酸,丝氨酸)三联体是TMPRSS12催化核心。重要的是我们发现TMPRSS12的mRNA在aMPV的靶器官存在。以上结果说明TMPRSS12有助于裂解aMPV/B F蛋白,为aMPV的预防与治疗提供技术支持。裂解的aMPV F蛋白介导膜融合的前提是与细胞表面的受体结合,但是aMPV F蛋白受体尚不清楚。已知的aMPV/B F蛋白含有保守的RDD基序。我们假设RDD与细胞表面的整合素结合启动F蛋白介导膜融合。为验证我们的假设,首先我们证实封闭整合素的多肽降低了aMPV/B F蛋白融合活性和病毒复制。同时我们通过抗体阻断,干扰试验和过表达确定是aMPV/B F蛋白融合活性和病毒复制所需的是整合素αv和β1。其次,过表达整合素αv和β1使得aMPV/B F蛋白和aMPV能在非允许细胞系分别吸附和感染。最后突变RDD成RAE,aMPV/B F蛋白吸附能力和融合活性显著下降。以上结果说明整合素αvβ1是aMPV/B F蛋白受体,促使aMPV/B F蛋白介导膜融合和aMPV/B感染。临床观察aMPV感染引起免疫抑制,但是免疫机理尚未阐明。I型干扰素(Type I interferons,IFN-I)像β-干扰素(Interferon-β,IFN-β)是机体防御的重要组分,在抵抗病毒和细菌感染中发挥重要作用。本研究发现aMPV/B感染的鸡和DF-1细胞后,IFN-β的表达降低。我们进一步证实是aMPV/B F蛋白抑制IFN-β的产生。突变aMPV/B F蛋白的100,101,93位点发现aMPV/B F蛋白裂解水平决定aMPV/B F蛋白抑制IFN-β程度。干扰试验和多肽阻断证实aMPV/B F蛋白下调IFN-β通过Toll样受体3(Toll-like receptors 3,TLR3)和Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)途径,干扰试验和流式分析证实aMPV/B F蛋白下调IFN-β与簇分化抗原14(Cluster of differentiation 14,CD14)有关。重要的是aMPV/B F蛋白降低脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)的免疫效应。以上结果说明aMPV/B引起鸡的免疫抑制好像是通过F蛋白与CD14结合从而降低IFN-β的产生。aMPV F蛋白介导膜融合需要经过裂解和结合受体的过程,剖析这些过程有助于了解aMPV的入侵和感染。上述研究证实,aMPV F蛋白的100,101和294位点决定胰酶和低pH调节F蛋白融合活性。我们进一步揭示aMPV/B F蛋白裂解不需要胰酶的原因是TMPRSS12可以裂解aMPV/B F蛋白。而且发现整合素αvβ1是aMPV/B F蛋白和aMPV/B感染的受体。另外,我们证实aMPV/B F蛋白裂解程度决定IFN-β表达量,同时发现CD14参与aMPV/B F蛋白下调IFN-β。本研究阐明了aMPV F蛋白介导膜融合机制和aMPV免疫抑制机理,有助于理解aMPV的发病机制。

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