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葡萄扇叶病毒基因变异分析及分子检测技术研究

文献类型： 学位论文

年份： 2016

导师姓名： 董雅凤

作者： 周俊

出版单位： 中国农业科学院

关键词： 葡萄扇叶病毒;巢式RT-PCR;实时荧光定量RT-PCR;序列分析

研究方向： 植物保护

摘要： 葡萄扇叶病毒(Grapevine fanleaf virus,GFLV)引起的葡萄扇叶病是全世界范围内最严重的葡萄病毒病害之一。GFLV可导致葡萄产量降低、品质下降,并且缩短葡萄园的使用寿命。我国对葡萄扇叶病的研究较晚,1980年首次在新疆发现,至今未获得中国GFLV分离物的全基因组序列。为了建立稳定、可靠、快速、灵敏的GFLV分子生物学检测方法,并调查GFLV在我国的发生分布情况以及分子变异特点,本研究针对GFLV开展了巢式RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR分子检测技术研究,对来自全国19个省、市、自治区的376株葡萄样品进行GFLV检测,以克隆测序得到的部分移动蛋白(movement protein,MP)和外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列进行变异分析,并展开GFLV全基因组序列扩增,主要取得了以下研究结果:根据GFLV的MP和CP基因分别设计引物,研究建立了GFLV的巣式RT-PCR,该方法检测结果准确可靠,与常规RT-PCR相比,具有较高的灵敏度,其中巣式引物FL-MPn1检测效果较好。另外,通过引物选择、条件优化和扩增效率比较,建立了以FL-HP1为引物的实时荧光定量RT-PCR方法,该方法检测灵敏度是巢式RT-PCR的10倍。利用建立的荧光定量方法测定葡萄样品中GFLV含量,并检测58个葡萄样品,结果表明不同葡萄样品中GFLV含量差异较大,与ELISA和巢式PCR相比,能检测出更多的GFLV分离物。对来自全国19个省、市、自治区的葡萄样品用ELISA及巢式RT-PCR进行检测,巢式RT-PCR检测376个样品,而ELISA检测其中279个样品。结果两套巢式PCR引物共检出阳性样品43个,检出率11.4%;而ELISA检出阳性样品61个,检出率21.9%;ELISA与巢式RT-PCR总共检出阳性样品72个,检出率为19.2%。19个地区中有9地区检出阳性样品,检出率分别在6.1%-54.2%。总共检测102个葡萄品种,28个品种检出GFLV,品种带毒率为27.5%,其中检出带毒率较高的有:品丽珠、蛇龙珠、贵人香、红地球、巨玫瑰、赤霞珠。本研究通过阳性PCR产物的克隆、测序获得了39条2BMP基因序列和22条2CCP基因序列,序列分析结果显示本研究获得的MP和CP基因间核苷酸序列相似性均较高(94.9-100%),而与其他GFLV分离物的序列比对结果显示:2BMP核苷酸和氨基酸序列相似性分别为78.3-86.6%和89.3-96.4%,2CCP核苷酸和氨基酸序列相似性分别为74.8-83.3%和81.4-91.4%。进化分析结果显示,本研究获得的分离物聚集成一个独立的亚组,表明分离物间起源相同,且进化过程中未受到其他地理起源的GFLV变种的影响。扩增得到中国GFLV分离物GFLV-SDHN的RNA1和RNA2进行全基因组序列扩增,其RNA1、RNA2全长核苷酸序列分别为7 367 nt、3 788 nt(不包括PolyA)。其中GFLV-SDHN的RNA1序列在迄今为止已报道的所有GFLV分离物中是最长的,其5’-UTR为266 nt,比其他GFLV分离物长22–24nt。GFLV-SDHN与其他GFLV分离物的序列及进化树分析结果显示,RNA1进化树中GFLV-SDHN与GDefV聚集成一个亚组,而区分于其他GFLV分离物;但RNA2进化树中GFLV-SDHN与GFLV、GDefV均不聚集成簇;另外,在GFLV-SDHN RNA2 2AHP检测到重组事件,以上结果说明GFLV-SDHN是一个全新的GFLV分离物。GFLV-SDHN RNA1、RNA2全基因组分离物登陆序列号分别为KU522584和KU522585。

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