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猪转铁蛋白受体与PPV-VP2相互作用的初步研究

文献类型： 学位论文

年份： 2015

导师姓名： 崔尚金

作者： 王晓玲

出版单位： 中国农业科学院

关键词： 猪细小病毒;猪转铁蛋白受体;荧光定量PCR;免疫共沉淀;稳定细胞系

研究方向： 兽医

摘要： 转铁蛋白受体(TfR)是位于细胞膜上的Ⅱ型跨膜糖蛋白,能够介导含铁的转铁蛋白从胞外转移至胞内。猪细小病毒(PPV)的基因组由长度约为5000nt的单股负链DNA构成,可编码三种结构蛋白(VP1,VP2及VP2)及三种非结构蛋白(NS1,NS2及NS3)。VP2占据病毒衣壳的绝大部分,约80%,并且能够自我组装成类病毒粒子。病毒的感染和复制起始于其与细胞表面受体的结合,这也是影响病毒宿主特异性、致病性及组织嗜性的关键因素之一。已有研究证实,与PPV同属的犬细小病毒(CPV)和猫瘟热病毒(FPV)的细胞表面受体是TfR,通过病毒的VP2蛋白与其结合,进而感染细胞。尽管PPV与CPV衣壳蛋白氨基酸的组成不尽相同,但其同源性较高,可达50~60%。基于此同源性可推测PPV也能够通过VP2与细胞表面的TfR结合,进而感染细胞。然而,很少有明确的证据表明,TfR是PPV的细胞表面受体,甚至有些证据表明,TfR不是PPV的细胞表面受体。为了明确TfR是否为PPV的受体,本实验进行前期的准备以及一些初步检测,主要包括定量PCR检测方法的建立、蛋白的表达及相互作用的初步鉴定、稳定表达猪TfR的HEK293细胞系的建立等。本研究针对PPV VP2、Tf R和管家基因β-actin的序列设计了特异性的引物,分别建立了SYBRGreen荧光定量PCR检测方法。结果表明:所构建的荧光定量PCR检测方法均无非特异性扩增,检测下线均在10拷贝以内,变异系数均小于3%。本研究建立的SYBR Green荧光定量PCR方法重复性好、敏感性高、特异性强,适用于对PPV及TfR的定量检测。利用所建立的SYBR Green荧光定量PCR检测方法对PPV感染ST前后PPV的增殖情况及TfR的转录时象进行了对应检测分析,结果表明:PPV在感染ST细胞前后消耗了一定的猪TfR来进行自身的增殖,TfR消耗特征符合作为PPV的细胞表面受体的特征。免疫共沉淀是一种研究蛋白之间相互作用的方法,本研究分别构建了VP2和TfR的重组表达质粒,利用激光共聚焦试验证实了VP2蛋白和TfR蛋白可在细胞膜上共定位,进一步才用免疫共沉淀试验验证二者是否具有相互作用,结果表明:二者不存在直接相互作用或不具有相互作用。为进一步探索二者的相互作用,本研究构建了稳定表达猪TfR的HEK293细胞系并对其进行了鉴定,结果表明,所构建的细胞系TfR基因的整合效率达90%以上,蛋白的表达效率也较高。而PPV对该细胞的感染试验表明PPV对该细胞不具有感染能力。以上试验结果表明TfR不是PPV的细胞表面受体,PPV的细胞表面受体还有待进一步研究。

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