文献类型： 中文期刊

作者： 赵雄伟 ¹ ; 李慧春 ¹ ; 陈鹏飞 ¹ ; 周书亭 ¹ ; 吴瑕 ¹ ; 劳梦琴 ¹ ; 童武 ¹ ; 高飞 ¹ ; 虞凌雪 ¹ ; 刘长龙 ¹ ; 孔宁 ¹ ; 单同领 ¹ ; 于海 ¹ ; 姜一峰 ¹ ; 童光志 ¹ ; 周艳君 ¹ ;

作者机构： 1.中国农业科学院上海兽医研究所

关键词： 猪流行性腹泻病毒;Nsp12;RNF7;蛋白相互作用

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN：

年卷期： 2021 年 005 期

页码： 461-467

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 猪流行性腹泻病毒（PEDV）编码的Nsp12蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）活性,在PEDV复制过程中发挥重要作用。为了研究与Nsp12蛋白相互作用的宿主细胞蛋白对PEDV复制的影响,本研究利用酵母双杂交技术将诱饵质粒pGBKT7-Nsp12与猪小肠绒毛上皮细胞（IECs）cDNA酵母表达文库进行杂交筛选,获得的阳性克隆经过测序鉴定证实为环指蛋白7（RNF7）,将pGBKT7-Nsp12与p GADT7-RNF7进行酵母回复验证,结果显示二者共转化后能分解SD/-4/X/A中的X-α-Gal形成蓝色菌落,表明Nsp12与RNF7蛋白在酵母中存在相互作用。同时,构建p CAGGS-Nsp12-HA和p CAGGS-Flag-RNF7真核表达载体,利用针对不同标签的抗体进行正向和反向免疫共沉淀鉴定,进一步证实PEDV Nsp12蛋白与RNF7蛋白之间存在直接相互作用;激光共聚焦显微镜观察发现Nsp12蛋白和RNF7蛋白在细胞质中存在共定位现象。为了分析宿主细胞中RNF7蛋白异常表达对PEDV增殖的影响,将构建的RNF7真核表达质粒pcDNA3.1-RNF7转染LLC-PK1细胞后,再用PEDV感染过表达RNF7的LLC-PK1细胞,通过western blot检测LLC-PK1细胞中PEDV N蛋白表达量,荧光定量PCR检测PEDV N基因转录水平,采用TCID50方法检测病毒滴度,结果显示,过表达RNF7后LLCPK1细胞内PEDV N蛋白表达量和N基因拷贝数均下降,其子代病毒滴度也明显低于正常对照组,表明过表达RNF7蛋白可以抑制PEDV的增殖。而利用si RNA-178敲低宿主细胞内源性RNF7蛋白的表达,再以MOI 0.01的PEDV感染后,对感染后不同时间的细胞样品进行western blot检测和病毒滴度检测,结果显示在PEDV感染后24 h,细胞内PEDV N蛋白表达量明显增加,PEDV的滴度在感染后18 h和24 h时分别是对照组的1.10倍和1.17倍。本研究结果首次证实了宿主细胞中RNF7蛋白表达对PEDV的复制发挥负调控作用,为深入探究PEDV复制调控的分子机制奠定了基础。