文献类型： 中文期刊

作者： 孙克会 ¹ ; 王欣慧 ² ; 陈克伟 ² ; 杨光璞 ² ; 王晓钧 ² ; 杜承 ² ; 郝力力 ¹ ;

作者机构： 1.西南民族大学畜牧兽医学院

2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

关键词： 单克隆抗体;线粒体抗病毒信号蛋白;原核表达;蛋白纯化

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2022 年 012 期

页码： 1317-1323

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）是机体先天免疫系统中维甲酸诱导基因I（RIG-I）信号通路唯一的接头蛋白，该蛋白对I型干扰素（IFN-I）的激活以及促炎因子的表达至关重要。因人源MAVS抗体不能识别马MAVS（eqMAVS）蛋白，限制了对马属动物病原体调控RIG-I信号通路的研究。为了制备eqMAVS单克隆抗体（MAb），本研究利用PCR方法克隆缺失跨膜域的eqMAVS（eqMAVSΔTM）并构建重组蛋白表达质粒pET32a-eqMAVSΔTM-his、pGEX-6p-1-eqMAVSΔTM-GST，转化大肠杆菌Rosetta（DE3）并经IPTG诱导后，分别利用His和GST亲和层析柱纯化，结果获得eqMAVSΔTM-his蛋白和eqMAVSΔTM-GST蛋白。以eqMAVSΔTM-his蛋白为免疫原免疫6周龄BALB/c小鼠，经常规免疫程序后进行杂交瘤细胞融合，并以eqMAVSΔTM-GST为检测蛋白以筛选杂交瘤细胞。结果显示共获得两株阳性杂交瘤细胞（4E9、3C4）。选用4E9制备腹水并将MAb纯化后，利用SDS-PAGE鉴定纯化的MAb，结果显示，制备的MAb包含重链、轻链，表明MAb纯化成功。对MAb进行亚类鉴定，结果显示其重链均为IgM型，轻链均为kappa型。间接ELISA检测结果显示1 mg/mL MAb的效价可达2×105。将其应用于western blot检测马单核巨噬细胞eMDM和马胎皮肤细胞NBL-6内源性的MAVS和在HEK293T细胞中过表达的eqMAVS；另外，将MAb应用于western blot检测不同剂量EIAV感染NBL-6后内源性eqMAVS蛋白的表达变化。结果显示，该MAb能够特异性识别NBL-6细胞和eMDM细胞内源性表达的eq MAVS蛋白，以及能够特异性识别HEK293T细胞中过表达的eqMAVS蛋白。EIAV感染试验结果显示，随着EIAV感染剂量的增加，内源性eqMAVS蛋白的表达量递减。上述结果表明，本研究制备了eqMAVS的MAb，并利用该MAb首次证明EIAV对eqMAVS的表达具有负调控作用，该MAb为研究EIAV对抗马源RIG-I信号通路的作用机制提供了重要的研究工具。