文献类型： 中文期刊

作者： 王燕 ¹ ; 陈为 ² ; 董明鑫 ¹ ; 孙成彪 ¹ ; 张剑旭 ¹ ; 常影 ² ; 刘文森 ¹ ; 许娜 ² ;

作者机构： 1.中国农业科学院长春兽医研究所

2.吉林医药学院

关键词： 慢病毒;CRISPR/Cas9;MyD88;RAW264.7细胞

期刊名称： 中国免疫学杂志

ISSN： 1000-484X

年卷期： 2022 年 014 期

页码： 1739-1743

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 目的：构建MyD88基因缺失的RAW264.7细胞株，为探寻MyD88基因的作用提供重要载体。方法：制备HBLV-Cas9-PURO慢病毒，感染RAW264.7细胞，得到RAW264.7-Cas9细胞株。依据CRISPR/Cas9系统原理，设计3条靶向MyD88基因的sgRNA，慢病毒包装后感染RAW264.7-Cas9细胞株，观察感染效果，PCR和Western blot验证MyD88基因敲除水平并筛选稳转细胞株。选取敲除效果最佳株，经LPS和PGN诱导后，荧光定量PCR和ELISA检测TNF-α表达和分泌。结果：HBLV-Cas9-PURO感染后RAW264.7细胞Cas9基因扩增明显升高，RAW264.7-Cas9细胞株构建成功。包装目的基因的慢病毒感染RAW264.7-Cas9后，荧光显微镜观察导入成功；PCR显示与对照组相比，HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP感染后MyD88基因表达显著下调；Western blot进一步证实，HBLV-m-MyD88 gRNA1-GFP和HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP感染后MyD88蛋白表达下降，且HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP组下降最为显著。LPS和PGN诱导HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP组细胞后，TNF-α表达和分泌水平均下调。结论：利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术成功构建稳定敲除MyD88基因的RAW264.7细胞株。