文献类型： 中文期刊

作者： 董泽霞 ¹ ; 林鑫 ² ; 周期律 ³ ; 王楠 ³ ; 黄雷 ⁴ ; 刘志国 ³ ; 冯政 ¹ ; 牟玉莲 ³ ;

作者机构： 1.佛山大学生命科学与工程学院

2.天津农学院动物科学与动物医学学院

3.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

4.中国农业科学院农业基因组研究所

关键词： CRISPR/Cas9;CD163基因;永生化猪肺泡巨噬细胞系(iPAMs);猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)

期刊名称： 中国畜牧兽医

ISSN： 1671-7236

年卷期： 2024 年 008 期

页码： 3471-3483

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】获得分化抗原163（cluster of differentiation 163,CD163）基因敲除的永生化猪肺泡巨噬细胞系（immortalized porcine alveolar macrophages, iPAMs）,并从细胞水平研究CD163蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）入侵过程中的作用。【方法】将靶向CD163基因第7外显子的sgRNA质粒（pX330-sgCD163）转染至iPAMs,转染48 h后通过有限稀释法筛选单克隆细胞并进行基因型鉴定，通过Western blotting和脱靶分析来筛选CD163基因敲除的iPAMs;通过实时荧光定量PCR、Western blotting、间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay, IFA）和半数细胞培养物感染量(50%tissue culture infective dose, TCID₅₀)等试验分析CD163基因敲除的iPAMs感染PRRSV的特征。【结果】测序结果表明，100株单克隆细胞中有1株CD163双等位基因敲除的iPAMs,敲除效率为1%;Western blotting结果显示，CD163基因敲除的iPAMs中检测不到CD163蛋白的表达，且在预测的脱靶位点未检测到脱靶效应。实时荧光定量PCR结果表明，与野生型iPAMs组相比，CD163基因敲除的iPAMs组病毒拷贝数极显著降低（P<0.01）;Western blotting和IFA结果表明，在接毒24 h后的CD163基因敲除的iPAMs组中未检测到PRRSV-N蛋白的表达；TCID₅₀试验结果同样显示，在CD163基因敲除的iPAMs组中未观察到细胞病变。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了CD163基因敲除的iPAMs,该细胞系可以完全抵抗PRRSV感染。该细胞系的建立为后续研究PRRSV与CD163蛋白的互作机制提供了新型试验材料。