文献类型： 中文期刊

作者： 翁慧婷 ¹ ; 郭惠明 ² ; 程红梅 ² ; 李君 ³ ; 张超 ³ ; 刘海洋 ⁴ ; 苏晓峰 ² ;

作者机构： 1.新疆维吾尔自治区农业科学院

2.中国农业科学院生物技术研究所农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室

3.河北农业大学生命科学学院

4.新疆农业科学院

关键词： 作物黄萎病;轮枝菌;数字PCR;实时荧光定量;精准检测

期刊名称： 生物技术通报

ISSN： 1002-5464

年卷期： 2025 年 41 卷 010 期

页码： 186-195

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】建立一种同时检测4种黄萎病致病菌的微滴式数字PCR（ddPCR）方法，为及时、准确定量监测该病原真菌的生长动态，进行早期诊断和风险评估奠定基础。【方法】通过比对4种黄萎病致病菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliae, Vd）、长孢轮枝菌（V. longisporum, Vl）、非苜蓿轮枝菌（V. nonalfalfae, Vna）和黑白轮枝菌（V. albo-atrum, Vaa）的ITS（Internal transcribed spacer）序列（Vd,KY039312.1;Vl,KX058040.1;Vna,KT362917.1和Vaa,MH856937.1），选取保守区域设计引物和探针。结合微滴式数字PCR和实时荧光定量PCR（qPCR）筛选最佳引物，优化ddPCR最佳反应体系，并测定方法的特异性与灵敏度。【结果】建立方法的最佳引物/探针组为Ver5；最佳退火温度为58℃，引物浓度为500 nmol/L和探针浓度为250 nmol/L。特异性检测结果显示，该方法能够特异性识别4种黄萎病致病菌，对包括7种真菌和6种细菌在内的非靶标微生物无交叉扩增；对于Vd、Vl、Vna、Vaa的检测限分别为2.1×10^-6、1.6×10^-6、6.9×10^-4、3.6×10^-5 ng/μL。选取50个棉花和50份土壤样品展开检测分析，结果表明相较于q PCR,ddPCR方法的检出率呈现出显著优势，且检测灵敏度分别提高了46%和51%。【结论】建立的ddPCR方法检测4种黄萎病致病菌特异性强，灵敏度高，稳定可靠，为黄萎病的精准检测提供了重要的技术手段。该方法有利于海关检验检疫与植物病虫害监管等领域，提高病害防控的科学性与时效性。