文献类型： 中文期刊

作者： 荆扬 ¹ ; 王玉淼 ¹ ; 李洋 ¹ ; 常辉 ² ; 马志倩 ¹ ; 李志伟 ¹ ; 肖书奇 ¹ ;

作者机构： 1.中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学动物医学与生物安全学院动物疫病防控全国重点实验室

2.塔里木大学动物科学与技术学院

关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒;过表达细胞系;ORF6基因;M蛋白;MARC-145细胞

期刊名称： 畜牧兽医学报

ISSN：

年卷期： 2024 年 003 期

页码： 1159-1169

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 为了给深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）ORF6基因编码的M蛋白的生物学功能提供重要试验材料，本研究首先利用慢病毒包装系统构建了过表达PRRSV ORF6基因的重组慢病毒质粒，将该质粒连同辅助质粒共同转染至HEK293T细胞获得重组慢病毒；之后将重组慢病毒感染MARC-145细胞，利用嘌呤霉素结合有限稀释法进行筛选，连续筛选3轮后建立了稳定表达PRRSV M蛋白的MARC-145^ORF6细胞系；并使用CCK-8试验评估过表达PRRSV M蛋白对MARC-145细胞生长的影响。利用RT-PCR、蛋白免疫印迹（Western blot）和间接免疫荧光（IFA）评估MARC-145^ORF6细胞系的传代稳定性并鉴定M蛋白的亚细胞定位，进一步利用RT-qPCR评估过表达M蛋白对MARC-145细胞的干扰素及相关调节基因的影响；此外，还测定了PRRSV在MARC-145^ORF6细胞系、MARC-145^Flag细胞系和MARC-145细胞中的病毒滴度并绘制多步生长曲线以比较其差异。CCK-8试验结果表明，过表达PRRSV M蛋白对MARC-145细胞活力无显著影响；RT-qPCR、Western blot和IFA等试验结果表明，MARC-145^ORF6细胞系能够表达PRRSV的M蛋白且在传代过程中稳定。此外，稳定表达PRRSV M蛋白显著下调了细胞系的Ⅰ型干扰素及其相关调节基因；多步生长曲线表明，MARC-145^ORF6细胞系促进PRRSV增殖，提高其病毒滴度。综上，本研究构建了可以稳定表达PRRSV M蛋白的MARC-145^ORF6细胞系，发现其Ⅰ型干扰素水平显著下调且促进PRRSV复制。本研究构建的MARC-145^ORF6细胞系将为M蛋白功能的深入研究提供重要生物材料。