文献类型： 中文期刊

作者： 高伟欣 ¹ ; 黄火清 ¹ ; 赵晶 ¹ ; 张鑫 ¹ ; 杨宁 ¹ ; 杨浩萌 ¹ ;

作者机构： 1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

关键词： Cas9蛋白;RNP复合体;大肠杆菌;活性验证

期刊名称： 生物技术通报

ISSN： 1002-5464

年卷期： 2022 年 38 卷 008 期

页码： 60-68

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： CRISPR/Cas9基因编辑技术具有操作简单、成本低廉和编辑效率高等优点,已经被广泛应用于动物、植物、微生物的基因编辑研究.在该技术体系中,发挥核酸剪切功能的是Cas9蛋白和guideRNA(gRNA)组装而成的核糖核蛋白复合体,即RNP(ribonucleoprotein)复合体.目前,应用体外组装的RNP复合体直接递送进入受体细胞进行基因编辑的研究越来越多,成为提高编辑效率、降低脱靶率的有效手段.本研究以获得具有高效剪切活性的RNP复合体为试验目的,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了Cas9蛋白,并通过His-tag亲和树脂对重组Cas9蛋白进行了纯化;同时,通过T7转录试剂盒对gRNA进行体外转录和纯化,使纯化的Cas9蛋白和gRNA自发组装成RNP复合体,经体外活性检测,RNP复合体具有很好的DNA双链剪切活性;将其与donor DNA共同转化到黑曲霉菌株,成功敲除了目标蛋白,编辑效率达到90%以上.本研究获得的RNP复合体,可以应用于丝状真菌的基因编辑,节约了试验时间与成本,并推动RNP介导的基因编辑技术在更多领域的应用.