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粪产碱菌(Alcaligenes faecalix)基因文库的构建和nifH基因同源顺序的克隆

文献类型： 中文期刊

作者： 海伟力 1 ; 郑洪刚 2 ; 尤崇杓 1 ; 王斌 2 ;

作者机构： 1.中国农业科学院原子能应用研究所

2.中国科学院遗传研究所

关键词： 粪产碱菌;基因文库;nif H基因

期刊名称： 遗传学报

ISSN： 0379-4172

年卷期： 1992 年 04 期

页码： 369-377

收录情况： SCI ; 北大核心 ; CSCD

摘要： 采用λ噬菌体置换型载体EMBL4,构建了Alcaligenes faecalis A-15 H1菌株总DNA的基因文库。用Sau3AⅠ限制酶完成部分酶切,取13—20kb大小的片段进行克隆。载体DNA经BamHⅠ和SaiⅠ完全双酶切,左右臂“退火”形成左右臂载体分子后再与外源片段连接。左右臂载体分子与外源片段按照1:1的分子比进行体外连接。用E.coli BHB2688和E.coli BHB2690制备的包装抽提物进行体外包装,所得基因文库效价测定为1.2×10~6 pfu,远远超过理论上所需的库容量。以nif H基因作为探针,经3轮噬菌斑原位杂交,从基因文库中筛选出含有其同源顺序的克隆,并得到了梯度点杂交的验证。对所得重组噬菌体克隆之一进行Southern转移杂交,结果证实,其3.5kb的EcoRⅠ酶切片段为nif H阳性杂交条带。将其克隆到质粒pUC19 DNA上后,转入受体菌JM101中。再次经Southern转移杂交,证明所得重组质粒克隆(pAFH)含有粪产碱菌中的与nifH基因有同源顺序的片段。

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