文献类型： 中文期刊

作者： 王丹 ¹ ; 吉艳红 ¹ ; 梁世蕊 ¹ ; 杨洁 ¹ ; 朱启运 ¹ ;

作者机构： 1.中国农业科学院兰州兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室

关键词： 新型鹅星状病毒;ORF2蛋白;纳米抗体;噬菌体展示技术

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2023 年 024 期

页码： 4956-4966

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】由新型鹅星状病毒（novel goose astrovirus, nGAstV）引起的雏鹅痛风病对我国养鹅业造成了重大经济损失。通过构建nGAstV纳米抗体（nanobody, Nb）噬菌体展示文库，获得识别nGAstV ORF2蛋白的特异性Nb，可为建立nGAstV抗体检测方法及研究nGAstV ORF2蛋白结构和功能奠定基础。【方法】使用蔗糖密度梯度离心方法纯化在LMH细胞中增殖的nGAstV,RT-PCR鉴定nGAstV并通过细胞病变测定nGAstV滴度。用0.06%甲醛溶液灭活纯化的nGAstV作为免疫原，免疫两周岁羊驼。首次免疫时用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏完全佐剂乳化后免疫，第2—5次免疫用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏不完全佐剂乳化。每间隔两周免疫一次，每次免疫剂量均为50μg。第5次免疫14 d后，通过间接ELISA方法测定羊驼血清中针对nGAstV的IgG抗体效价。待IgG抗体效价达到构建噬菌体抗体展示文库标准时，分离羊驼外周血淋巴细胞（peripheral blood lymphocyte, PBL），然后提取PBL总RNA将其反转录为cDNA，利用巢氏PCR方法扩增重链抗体重链可变区（variable domain of the heavy chain of heavy chain antibodies, VHH）基因，将其构建至pComb噬菌体载体并结合噬菌体展示技术构建nGAstV Nb噬菌体展示文库，计算该文库库容量并分析其多样性。nGAstV作为靶抗原，通过三轮富集淘选初步获得与nGAstV反应的重组噬菌体Nb阳性克隆，将其克隆至pcDNA3.1-Fc真核表达载体并进行测序分析，将测序成功且序列不同的质粒转染至HEK-293F细胞中表达，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定表达情况。以nGAstV为靶标抗原，利用间接ELISA方法和Western blot试验对表达成功的Nb进行特异性、反应活性验证，并以nGAstV ORF2蛋白为靶标抗原，利用间接ELISA方法对Nb进行亲和力验证，获得生物学活性较好的Nb。【结果】RT-PCR结果显示，nGAstV增殖成功；Reed-Muench法分析nGAstV滴度达4.38 Log₁₀TCID₅₀/mL。羊驼经5次免疫nGAstV后，通过间接ELISA方法测得其血清中针对nGAstV的抗体效价达到1:64 000；利用巢氏PCR方法扩增出VHH并成功构建库容量为3.8×10~8 CFU/mL的nGAstV Nb噬菌体展示文库；遗传进化树分析显示，该噬菌体Nb库多样性良好。三轮富集淘选后，初步获得39株与nGAstV反应的重组噬菌体纳米抗体阳性克隆，其中有25株序列不同；SDS-PAGE鉴定结果显示，共有10株Nb在HEK-293F细胞中表达成功。通过ELISA、Western blot验证进一步获得8株与nGAstV ORF2蛋白特异性反应的Nb，且1株Nb生物学活性最好。【结论】首次筛选到与nGAstV ORF2蛋白特异性反应的Nb，为nGAstV的基础研究和检测方法提供材料。