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STAG2基因敲除的IPEC-J2细胞系构建及其对PDCoV复制影响的研究

文献类型： 中文期刊

作者： 张洪玲 1 ; 陈建飞 2 ; 石照蓉 2 ; 李明蔚 2 ; 吴洋 2 ; 郭龙军 2 ; 冯力 1 ;

作者机构： 1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院

2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪消化道团队

关键词： 猪德尔塔冠状病毒;基质抗原2;CRISPR/Cas9;敲除细胞系

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2022 年 44 卷 005 期

页码： 550-554

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 为探究猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)中基质抗原2(STAG2)因子对猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)复制的影响,本研究针对STAG2基因设计并合成sgRNA,将其克隆至lentiCRISPR v2载体构建重组表达质粒.将重组质粒转染至IPEC-J2细胞后,利用嘌吟霉素(Puromycin)采用有限稀释法进行亚克隆,筛选STAG2基因缺失的单克隆细胞株,并经western blot鉴定后最终获得一株STAG2缺失的单克隆稳定细胞系IPEC-J2-STAG2-/-(KO).利用western blot方法鉴定不同代次STAG2敲除细胞的遗传稳定性,结果显示,IPEC-J2-STAG2-/-细胞具有良好的遗传稳定性.为探究STAG2基因对PDCoV复制的影响,本研究将PDCoV分别感染IPEC-J2-STAG2-/-细胞和野生型IPEC-J2细胞(WT),采用荧光定量PCR、western blot方法检测细胞中PDCoV N基因mRNA转录及其蛋白表达水平.结果显示,与WT组相比,IPEC-J2-STAG2-/-细胞中PDCoV N基因mRNA转录水平及其蛋白表达水平均极显著降低(P<0.01),表明STAG2缺失会抑制PDCoV在IPEC-J2细胞中的复制.为探究STAG2缺失是否刺激宿主细胞产生天然免疫应答,本研究利用荧光定量PCR方法检测敲除细胞中3种天然免疫应答相关干扰素刺激基因(ISGs)的转录水平,结果显示,与WT相比,IPEC-J2-STAG2-/-细胞内相关ISGs转录水平显著升高(P<0.01),表明STAG2缺失后宿主细胞启动天然免疫应答进而抑制PDCoV的复制.本研究首次发现STAG2基因缺失后显著上调了 IPEC-J2细胞天然免疫抗病毒基因的转录水平,从而抑制PDCoV的复制,为研究PDCoV和宿主因子相互作用提供了新思路.

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