文献类型： 中文期刊

作者： 刘大凯 ¹ ; 韩郁茹 ¹ ; 张记宇 ¹ ; 张燎原 ¹ ; 冯廷帅 ¹ ; 杨小曼 ¹ ; 曾苗苗 ¹ ; 时洪艳 ¹ ; 秦毅斌 ² ; 石达 ¹ ; 冯力 ¹ ;

作者机构： 1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国家重点实验室

2.广西兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室

关键词： 猪急性腹泻综合征冠状病毒;S蛋白;原核表达;多克隆抗体;初步应用

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2024 年 005 期

页码： 499-504

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 为制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)纤突蛋白(S)的多克隆抗体(PAb)，本研究经PCR扩增SADS-Co V S蛋白S1亚基C端结构域(S1-CTD)基因片段(384 bp)，并将其克隆至原核表达载体p GEX-6p-1中，构建重组质粒p GEX-6p-1-S1-CTD，经双酶切和测序鉴定正确后，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，利用IPTG诱导表达，通过western blot鉴定重组S1-CTD蛋白(rS1-CTD)的表达及反应原性。结果显示，r S1-CTD以包涵体的形式表达，在40 ku处出现特异性条带。诱导表达后的r S1-CTD经不同浓度尿素重悬并超声离心，SDS-PAGE检测后切胶纯化，得到纯化的重组蛋白。利用BCA试剂盒测得蛋白的浓度为33μg/m L。将该重组蛋白乳化后经3次免疫新西兰大白兔，并在3免一周后采血，分离血清获得S1-CTD蛋白PAb。将SADS-Co V感染Vero E6细胞24 h后，以获得的兔PAb为一抗，分别采用western blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测该PAb的反应原性。Western blot结果显示，在约250 ku处出现特异性条带，而阴性对照组无该条带；IFA结果显示，SADS-Co V感染的细胞中出现绿色荧光，而阴性对照细胞无绿色荧光。将SADS-Co V感染仔猪的回肠组织制备病理切片，以制备的PAb为一抗，通过免疫组织化学(IHC)检测SADS-Co V的抗原。结果显示，该组织切片中出现棕色阳性信号，而阴性对照仔猪回肠组织切片则无该棕色信号。表明该PAb可与感染SADS-Co V的仔猪回肠组织中的相应抗原发生特异性免疫反应。综上所述，本实验制备的S1-CTD蛋白PAb具有良好的反应原性和免疫原性，可以用于western blot、IFA、IHC检测体内外SADS-Co V的感染，为后续SADS-Co V检测方法的建立及S蛋白生物学功能的研究奠定基础。