文献类型： 中文期刊
作者： 张林 1 ; 吴金恩 1 ; 任玫 1 ; 王学飞 1 ; 李硕 1 ; 王嘉宁 1 ; 魏凡华 1 ; 郭慧琛 1 ;
作者机构： 1.宁夏大学农学院;中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室兰州大学动物医学院;甘肃农业大学动物医学院
关键词： CRISPR/Cas9;RALY基因;基因敲除;口蹄疫病毒
期刊名称： 中国兽医科学
ISSN： 1673-4696
年卷期： 2023 年 53 卷 009 期
页码： 1115-1121
收录情况： 北大核心 ; CSCD
摘要： 利用CRISPR/Cas9 技术建立敲除RNA结合蛋白(RALY)基因的PK-15 细胞系PK-15-RALY-/-,并初步探究RALY对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响.根据GenBank中猪的RALY基因的外显子,设计合成sgRNA并克隆至PX459 载体;将质粒转染PK-15 细胞,并采用有限稀释法筛选单克隆细胞株,经West-ern-blot及测序检测RALY基因的敲除效果.通过RT-qPCR检测FMDV感染PK-15-RALY-/-和PK-15 细胞后FMDV mRNA的转录水平,Western-blot检测FMDV-VP0、FMDV-VP3 和FMDV-VP1 的表达水平,最后检测子代病毒感染力.测序结果证实RALY基因发生了移码突变,且Western-blot无法检测到PK-15-RALY-/-细胞中RALY蛋白的表达.FMDV感染两种细胞后,RT-PCR结果显示,FMDV在PK-15 细胞中的mRNA水平显著低于PK-15-RALY-/-细胞,Western-blot结果显示,VP0、VP3 和VP1 蛋白在PK-15-RALY-/-细胞中的表达显著高于PK-15 细胞,病毒感染力测定结果显示,PK-15-RALY-/-细胞中子代病毒滴度显著高于PK-15 细胞.上述结果表明,本研究成功构建了RALY基因敲除的PK-15 细胞系,首次表明RALY可以抑制FMDV复制,为进一步开展RALY在细胞内调控病毒复制机制研究奠定了基础.
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