文献类型： 中文期刊

作者： 王田田 ¹ ; 于瑞明 ¹ ; 张莉萍 ² ; 白英杰 ² ; 张中旺 ² ; 潘丽 ² ; 张全伟 ¹ ; 刘新生 ² ;

作者机构： 1.甘肃农业大学生命科学技术学院

2.中国农业科学院兰州兽医研究所

关键词： 猪德尔塔冠状病毒(PDCoV);N蛋白;单克隆抗体;双抗体夹心ELISA

期刊名称： 中国畜牧兽医

ISSN： 1671-7236

年卷期： 2025 年 52 卷 011 期

页码： 5326-5337

收录情况： 北大核心

摘要： [目的]制备猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白的单克隆抗体并建立一种检测PDCoV抗原的双抗体夹心ELISA方法,为猪群PDCoV感染情况的临床快速、准确检测提供技术支持.[方法]通过原核表达系统表达PDCoV N蛋白并验证,用其免疫BALB/c雌鼠,利用杂交瘤细胞融合技术筛选制备抗PDCoV N蛋白的特异性单克隆抗体,并通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)验证单克隆抗体的反应性和特异性.将筛选到的单克隆抗体进行辣根过氧化物酶(HRP)标记,并分别与未标记的单克隆抗体两两组合配对,选择最优抗体用于双抗体夹心ELISA检测方法的建立,通过棋盘法优化捕获抗体包被浓度和酶标抗体稀释度等条件,条件优化后通过梯度稀释法确定该方法的PDCoV N蛋白和PDCoV的检出限,并验证其重复性和特异性,最终检测临床样品验证该方法与反转录实时荧光定量PCR的一致性.[结果]成功表达出纯度较高的PDCoV N蛋白,用其免疫小鼠4次后其血清抗体效价达到1∶256 000,通过杂交瘤融合技术成功筛选到6株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株(5D2-1、5D2-2、6G7-1、6G7-2、3C5和6F10).Western blotting、IFA结果显示,筛选到的6株单克隆抗体可与PDCoV N蛋白特异性反应.配对试验结果表明,最佳捕获抗体为5D2-1,最佳检测抗体为6G7-1-HRP.本研究建立的双抗体夹心ELISA方法对PDCoV N蛋白的检出限为2 ng/mL,全病毒的检出限为7.89×103 TCID50/mL,具有良好的灵敏性.批间和批内重复试验变异系数均<10%,且未见与其他常见猪肠道病毒发生反应,具有良好的重复性和特异性.临床样本检测结果显示,建立的双抗体夹心ELISA方法与反转录实时荧光定量PCR方法符合率为88.19%,Kappa值为0.761,表明该方法可用于PDCoV临床样品的检测.[结论]本研究成功筛选制备了 6株针对PDCoV N蛋白的特异性单克隆抗体,建立了一种特异性好、灵敏度高的PDCoV双抗体夹心ELISA检测方法,为PDCoV临床诊断提供了新方法.