文献类型： 中文期刊

作者： 高利利 ¹ ; 王聪聪 ¹ ; 杨帆 ¹ ; 曹伟军 ¹ ; 张向乐 ¹ ; 刘湘涛 ¹ ; 朱紫祥 ¹ ; 郑海学 ¹ ;

作者机构： 1.家畜疫病病原生物学国家重点实验室

关键词： CRISPR/Cas9;RPSA;基因缺失细胞;塞内卡病毒

期刊名称： 微生物学报

ISSN： 0001-6209

年卷期： 2021 年 61 卷 007 期

页码： 1945-1956

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： [目的]利用CRISPR/Cas9技术建立RPSA基因缺失的乳仓鼠肾细胞(baby hamster kidney cells,BHK21)细胞系,为开展RPSA调控病毒复制机制研究提供工具;同时,初步探究RPSA对塞内卡病毒复制的影响.[方法]根据GenBank中仓鼠的RPSA基因序列找到产生不同转录本的共同外显子段,设计并合成4对引导RNA(sgRNA),分别构建至PX330载体中;经过筛选选择打靶活性较高的PX330-RPSA-sgRNA2质粒用于后续敲除细胞系构建.将PX330-RPSA-sgRNA2质粒转染BHK21细胞后,通过有限稀释法筛选单克隆细胞,通过Western blot及序列测定检测RPSA基因的敲除.通过Western blot及qPCR分析比较塞内卡病毒在野生型及RPSA基因敲除BHK21细胞中的复制差异.[结果]Western blot检测及序列测序证实了RPSA基因敲除单克隆细胞构建成功.进一步研究发现,塞内卡病毒在RPSA基因敲除细胞中的复制水平明显低于其在野生型BHK21细胞中复制的水平.[结论]成功构建了RPSA基因敲除的BHK21细胞系,首次表明RPSA对塞内卡病毒的复制具有重要作用,为进一步开展RPSA在细胞内调控病毒复制机制研究奠定基础.