文献类型： 中文期刊

作者： 孟朝轶 ¹ ; 王运路 ¹ ; 姚一龙 ¹ ; 席广银 ¹ ; 牛家强 ¹ ; 索朗斯珠 ¹ ; 郭敏 ¹ ; 徐业芬 ¹ ;

作者机构： 1.西藏农牧学院动物科学学院;中国农业科学院深圳农业基因组研究所;中国农业大学动物科学技术学院

关键词： lncRNA;bta-miR-146a;凋亡;颗粒细胞;牦牛

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2024 年 57 卷 004 期

页码： 797-809

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： [背景]卵泡颗粒细胞(Granulosa cells,GCs)凋亡是导致卵泡闭锁的重要原因,竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)机制已被证明参与调控GCs的凋亡过程.前期牦牛卵巢转录组测序发现lncRNA-MSTRG.7889.1与bta-miR-146a具有结合位点,而bta-miR-146a和Smad4存在靶向关系.[目的]通过探究影响牦牛卵泡GCs凋亡的ceRNA分子调控机制,为揭示牦牛生殖调控的奥秘奠定基础.[方法]采集和分离成年母牦牛的健康和闭锁卵泡,利用 RT-qPCR 法检测lncRNA-MSTRG.7889.1、bta-miR-146a和Smad4 在卵泡中的表达.制作牦牛健康和闭锁卵泡组织切片,TUNEL检测健康卵泡和闭锁卵泡中GCs的凋亡情况;荧光原位杂交分析lncRNA-MSTRG.7889.1、bta-miR-146a和Smad4在卵泡中的定位.体外分离和培养牦牛GCs,分别转染Smad4 过表达载体和bta-miR-146a mimics,流式细胞术检测GCs细胞凋亡率,Western blot检测促凋亡蛋白CASPASE3和BAX,抑凋亡蛋白BCL-2的表达;GCs共转染Smad4过表达载体和bta-miR-146a mimics后,探究bta-miR-146a是否靶向Smad4 影响牦牛GCs的凋亡.将lncRNA-MSTRG.7889.1 过表达慢病毒载体感染GCs,流式细胞术和Western blot检测lncRNA-MSTRG.7889.1 对GCs凋亡的影响;lncRNA-MSTRG.7889.1 载体和bta-miR-146a mimics共转染 GCs,进一步分析 lncRNA-MSTRG.7889.1 是否竞争性结合 bta-miR-146a 靶向 Smad4 影响牦牛 GCs 的凋亡.[结果]lncRNA-MSTRG.7889.1和Smad4 mRNA在牦牛健康卵泡中的表达极显著高于闭锁卵泡(P<0.01),而bta-miR-146a的表达则相反(P<0.01).TUNEL检测结果显示,在闭锁卵泡中GCs的荧光强度极显著高于健康卵泡(P<0.01),说明闭锁卵泡中GCs凋亡显著高于健康卵泡.荧光原位杂交结果显示Smad4、bta-miR-146a和lncRNA-MSTRG.7889.1在牦牛卵泡中共表达,其在健康和闭锁卵泡中的表达与RT-qPCR结果基本一致,提示可能存在ceRNA机制参与牦牛健康卵泡发育和卵泡闭锁过程.在牦牛GCs过表达Smad4使细胞凋亡率显著降低(P<0.01),CASPASE3和BAX蛋白的表达显著降低(P<0.01),BCL-2蛋白的表达显著升高(P<0.01);过表达bta-miR-146a使GCs凋亡率显著升高(P<0.01),CASPASE3和BAX蛋白的表达显著升高(P<0.01),BCL-2蛋白的表达显著降低(P<0.01);bta-miR-146a靶向抑制Smad4的表达(P<0.01);Smad4和bta-miR-146a共转染GCs,结果显示bta-miR-146a靶向抑制Smad4降低前者对GCs凋亡的促进作用(P<0.01).过表达lncRNA-MSTRG.7889.1使牦牛GCs凋亡率显著降低(P<0.01),CASPASE3 和BAX蛋白的表达显著降低(P<0.01),BCL-2 蛋白的表达显著升高(P<0.01);lncRNA-MSTRG.7889.1 显著抑制bta-miR-146a的表达(P<0.01).将lncRNA-MSTRG.7889.1 和bta-miR-146a共转染GCs,结果表明lncRNA-MSTRG.7889.1 靶向bta-miR-146a降低后者对GCs凋亡的促进作用(P<0.01);而且RT-qPCR法和Western blot检测结果表明lncRNA-MSTRG7889.1 竞争性结合bta-miR-146a促进Smad4 mRNA和蛋白水平的表达(P<0.01).[结论]lncRNA-MSTRG.7889.1竞争性结合bta-miR-146a促进Smad4的表达抑制牦牛GCs的凋亡.