文献类型： 学位论文
年份： 2016
导师姓名： 万建民
作者： 甘露
出版单位： 中国农业科学院
关键词： 水稻;蜡质;脂肪酸延伸;WSL3;WSL4
研究方向： 生物化学与分子生物学
摘要： 陆地植物表面覆盖着一层蜡质层,蜡质作为植物表面与环境之间的第一层屏障,具有重要的功能。蜡质能防止植物水分的流失,能屏蔽过量的紫外线,能形成自洁式的表面抵御外来的灰尘,能作为物理屏障来抵挡害虫和病原菌的侵害,还能在器官边界确定上起到重要的作用。水稻作为重要的模式作物,对水稻蜡质控制基因进行研究,进而利用其改良水稻的抗逆能力,具有重要的意义。本文以两个水稻叶片蜡质减少突变体Wax crystal-sparse leaf 3(wsl3)和Wax crystal-sparse leaf 4(wsl4)为材料,在表型鉴定的基础上,利用图位克隆技术对目标基因进行了分离,进一步对其功能进行了初步的研究,主要内容如下:1.蜡质突变体wsl3和wsl4的表型分析通过对日本晴组培突变体库的筛选,获得了水稻叶片蜡质减少的突变体wsl3和wsl4。两个突变体均呈现叶片沾水的表型,且wsl4突变体比野生型株高略矮,分蘖数减少。透射电镜(TEM)观察发现wsl3和wsl4突变体叶片表皮增厚。扫描电镜(SEM)观察发现突变体叶片表面蜡质晶体显著性降低。GC-MS测定发现尽管突变体叶片表面角质含量与野生型相当,但是,突变体叶片表面蜡质各成分含量相对于野生型则显著性下降。生理学实验表明,wsl3和wsl4突变体的细胞膜通透性都有一定程度的升高。2.蜡质代谢合成基因WSL3和WSL4的图位克隆和功能验证利用图位克隆技术,我们将WSL3定位于4号染色体InDel标记M-2396和M-2404之间83kb区间内,对该区间的基因测序发现LOC_Os04g40730第一个外显子的736和737的两个连续的碱基GC突变为TT,导致了所编码的蛋白质第207位的氨基酸由丙氨酸突变为苯丙氨酸。WSL4基因定位于3号染色体InDel标记M-6283和M-6341的58 kb区间内,对该区间基因测序发现Loc_Os03g12030基因的1281位的碱基由G突变为A,位于第二个外显子上,导致了所编码的蛋白质第312位的氨基酸由缬氨酸突变为甲硫氨酸。生物信息学分析结果表明LOC_Os04g40730和Loc_Os03g12030分别编码KCR和KCS类蛋白,都是蜡质合成途径的基因。进一步的遗传互补和RNAi干扰实验表明这两个基因即为目标基因。3.WSL3和WSL4基因的时空表达分析及亚细胞定位利用实时荧光定量RT-PCR和GUS表达实验对WSL3和WSL4两个基因的表达模式进行了分析。结果表明,WSL3和WSL4在根、茎、叶、花等各个组织中均有表达,属于组成型表达基因。构建WSL3和WSL4基因的亚细胞定位GFP载体,在烟草中瞬时表达,发现它们都能与ER marker共定位,表明WSL3和WSL4蛋白都定位于内质网上。4.WSL3蛋白具有脂肪酸延长酶活性在酵母ybr159wΔ突变体中异源表达水稻的WSL3基因,其生长缺陷的表型能得到恢复。当WSL3基因与拟南芥的FAE1基因在ybr159wΔ突变体中共表达的时候,能在酵母ybr159wΔ突变体检测到20:0,22:0,20:1Δ11以及22:1Δ13四种脂肪酸产物,这些结果表明WSL3具有KCR酶的脂肪酸延长酶活性。
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