文献类型： 学位论文
年份： 2015
导师姓名： 孔宪刚
作者： 蒋露
出版单位： 中国农业科学院
关键词： 鸡传染性喉气管炎病毒;致病性;基因组;序列分析
研究方向： 预防兽医学
摘要： 鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)能引起鸡的一种呼吸道的传染病,具有高度接触性和急性感染的特征,该病被称为鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis,ILT)。急性感染的鸡群可出现高的发病率和死亡率,慢性感染可引起结膜炎、产蛋和蛋品质下降,从1925年首次报道本病以来,已在全球各地流行,近些年来,在我国多地也呈流行趋势,给养鸡业造成的损失不容忽视。为研究ILTV LJS09株鸡胚源毒经在LMH上适应后致病性的变化,本研究以ILTV LJS09株鸡胚源毒和LMH细胞适应第四代的毒分别人工感染SPF鸡,通过评价两感染组的临床症状、临床得分、临床指数(1.4和0.7)、发病率(80%和60%)和死亡率(10%和0)、剖检变化以及鸡胚源毒感染组病理组织学变化,血清抗体水平变化规律,ILTV在鸡体内的嗜性器官以及各个器官中病毒的载量这些指标,继而评价鸡胚源毒和LMH细胞适应毒的致病效果,并比较其致病力的强弱,结果表明两感染组有相似的临床症状和剖检变化,血清抗体水平变化趋势相同,ILTV嗜性器官相同,但鸡胚源毒感染组的临床得分、临床指数、发病率和死亡率、血清抗体水平较LMH细胞适应毒感染组高,表明ILTV LJS09株鸡胚源毒比LMH细胞适应毒的致病力强。这些评价指标及结果为了解我国传染性喉气管炎病毒的致病性提供了参考。本实验室于2014年从黑龙江省和河北省分离得到两株ILTV,分别命名为LHLJ1403和LHB1409株。经SPF鸡胚分离,并经PCR和测序鉴定后确定其为ILTV。将这2株分离株在LMH细胞上适应,经噬斑纯化后得到了纯化的病毒,通过电镜观察和间接免疫荧光检测确定了纯化的病毒为ILTV。为进一步了解我国ILTV毒株的流行病学特性及分子生物学特点,用PCR的方法测定了这两株分离株的全基因组序列。通过将全基因组片段化,形成106个短片段,利用106对引物,分别进行克隆测序,由于内部重复区和末端重复区具有倒置重复的特点,因此共利用了17对引物,通过锚定PCR和嵌套PCR相结合的方法准确确定其位置和序列。将得到的两株分离株的所有克隆片段的序列拼接在一起,获得两株分离株的基因组全长序列。LHLJ1403株的基因组全长为153222 bp,具有79个ORF;LHB1409株的基因组全长为153213 bp,同样具有79个ORF。利用DNAStar、MEGA、DNAMAN和ORF Finder等生物学软件对序列进行分析,并将其与已公布的参考序列进行比对(用于比对的参考序列:SA2、A20、LT Blen、1874C5、USDA、81658、63140、Laryngo、Serva、LJS09)。通过同源性比对,LHLJ1403和LHB1409株相似性为99.02%,LHLJ1403和LT Blen株的相似性最高达99.49%,LHB1409和63140株的相似性最高达99.19%。与SA2和A20株相比,LHLJ1403和LHB1409株UL区693~706位缺失14 bp,3297~3485位缺失189 bp,3672~3690位缺失19 bp,4662~4693位缺失了32 bp的序列。将参考序列的重复区相互比较,发现LHLJ1403和LHB1409株的内部(IRS)和末端重复区(TRS)都有857 bp片段的大段缺失,而在USDA株的重复序列中并不缺失这段片段,但与Serva株相比,LHLJ1403和LHB1409株的IRS和TRS均存在217 bp的缺失。此外,LHLJ1403和LHB1409株重复区的DNA复制起点Ori S只含有结合蛋白(OBP)的结合位点,而AT富集区及周围序列存在缺失。LHLJ1403和LHB1409株的糖蛋白g B、g C、g D和g H/g L与UASD株相比,部分氨基酸位点发生了突变。将分离毒株的全基因组序列与参考毒株进行比对并进行遗传进化分析,结果表明LHLJ1403与美国疫苗株LT Blen和Laryngo的亲缘关系较近,并位于同一分支;LHB1409与美国疫苗株Serva和美国强毒株63140株缘关系较近,且它们位于同一分支。本研究测定了我国两株ILTV分离毒株的全基因组序列,并将其与已发表的其他强毒株、弱毒株或疫苗株的基因组序列进行比对和分析,其结果为ILTV分子遗传特性和分子生物学的研究奠定了基础,为了解我国ILT的流行情况、该病的防控及新型疫苗的研发提供了信息。
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