文献类型： 学位论文

年份： 2015

导师姓名： 李世东

作者： 孙占斌

出版单位： 中国农业科学院

关键词： 粉红螺旋聚孢霉;核盘菌;菌寄生相关基因;过表达;基因敲除

研究方向： 植物病理学

摘要： 粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea,又名粉红粘帚霉Gliocladium roseum)是一类重要的菌寄生真菌,可以防治核盘菌、灰葡萄孢、镰刀菌、立枯丝核菌等引起的多种植物真菌病害,同时还可以促进作物生长,在温室和田间试验中广泛应用,具有巨大的生防潜力。但目前尚未见该菌寄生核盘菌菌核分子机制的报道。为阐明粉红螺旋聚孢霉寄生菌核机制,筛选菌寄生相关基因,本研究以实验室前期分离得到的一株高效粉红螺旋聚孢霉菌株67-1为材料,通过高通量测序技术分别获得了67-1全基因组序列和寄生核盘菌菌核转录组信息,并研究了其脂滴包被蛋白基因per3、几丁质酶基因chi67和单加氧酶基因mono67在寄生菌核过程中的作用。本研究以67-1菌丝为材料,提取基因组DNA后进行全基因组测序和分析。首先构建了三个PE文库(170 bp,300 bp和500 bp)和1个MP文库(5 kb),采用Illumina Hiseq 2500平台进行测序,测序覆盖度大于150×,对序列进行组装后共得到1,552个contigs(重叠群),N50为99,664 bp。这些contigs继续组装形成475个scaffolds,N50为569,489 bp。最终组装信息表明,67-1基因组大小为55.4 Mb,G+C含量为49.2%。通过Fgenesh软件分析,共预测出20,747个基因,与NCBI NR数据库比对,共有13,474个找到同源序列。67-1基因组序列信息为后续研究其与植物病原真菌的互作提供分子基础。为研究粉红螺旋聚孢霉67-1寄生核盘菌菌核分子机制并筛选寄生相关基因,本研究利用高通量测序和实时荧光定量PCR技术筛选获得了67-1寄生核盘菌菌核不同时间间隔(8 h、24 h和48 h)的差异表达基因。转录组测序和分析表明共得到26,351个单值基因,其中有18,525个基因可以注释到NR、KEGG、Swiss-Prot、GO和COG数据库。在3个寄生时间段分别有3,217、4,025和4,274个基因上调表达,2,739、1,249和1,064个基因下调表达。对差异表达基因进行实时荧光定量PCR检测,发现菌核诱导下12个基因明显上调表达,与转录组分析一致,为研究粉红螺旋聚孢霉寄生相关基因提供候选基因。内参基因是应用实时荧光定量PCR精确检测基因表达量的基础。为了筛选67-1寄生菌核过程中稳定表达的内参基因,本研究选择了7个真菌常用的管家基因,18S核糖体蛋白基因(18S r RNA)肌动蛋白基因(Actin),β-微管蛋白基因(β-tubulin),延伸因子基因(Elongation factor),泛素基因(Ubiquitin),泛素结合蛋白基因(Ubiquitin-conjugating enzyme)和甘油3-磷酸脱氢酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase),通过ge Norm、Bestkeeper和Normfinder三个常用内参基因表达稳定性分析软件进行分析,发现延伸因子基因表达在不同阶段均最为稳定,可以用于67-1寄生核盘菌菌核相关基因的定量。本文通过67-1寄生菌核转录组数据分析,得到一个编码脂滴包被蛋白的基因per3、一个几丁质酶基因chi67和一个单加氧酶基因mono67,这三个基因均在菌核诱导下显著上调表达。通过全基因组信息获得3个基因全长DNA序列。分别对per3和chi67过表达,发现突变菌株对菌核的寄生能力显著提高,16 h达到100%。防治大豆菌核病温室盆栽试验表明,per3转化子6-4防治大豆菌核病效果最好,达到76.5%,比野生菌株和多菌灵分别高23.8%和20.9%。这是脂滴包被蛋白在菌寄生菌中首次作为生防因子的报道。chi67转化子在16 h时对菌核寄生力比野生菌株高130%,对大豆菌核病防效分别比野生菌株和多菌灵高31.7%和28.7%,且产几丁质酶能力是野生菌株的2.4倍。对mono67基因进行敲除验证,利用同源重组原理构建了mono67敲除载体,并成功获得了敲除突变株Δmono67。室内和温室生测表明,Δmono67对核盘菌菌核的侵染起始时间与野生菌株基本一致,但寄生水平由野生菌株的四级降为三级,并且对盆栽大豆菌核病的防效明显下降。相关研究为进一步开发寄生相关基因提供基础。