文献类型： 中文期刊

作者： 钟发刚 ¹ ; 王新华 ¹ ; 沈敏 ¹ ; 温建新 ¹ ; 张银国 ¹ ;

作者机构： 1.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2000 年 22 卷 06 期

页码：

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 牛病毒性腹泻病毒 (ＢＶＤＶ)属于黄病毒科瘟疫病毒属 (Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ) [2 ] ,是一种重要的动物病毒。它不仅是牛病毒性腹泻的重要病原 ,也是青海、内蒙古和新疆地区羔羊腹泻的重要病原之一。自 80年代初在国内发现该病并分离到病原以来 ,已有 15个省、市、自治区陆续查出该病的抗体和分离到病原。王治才等[3] 对新疆 7个地区的羔羊腹泻作了ＢＶＤＶ感染调查 ,平均阳性率为 73.6%。笔者在从事ＢＶＤＶ单克隆抗体研制过程中 ,先后分离到 2株ＢＶＤＶ野毒株 ,现将结果报道如下。1　材料和方法1.1　ＭＤＢＫ细胞　中国科学院上海细胞所惠赠。1.2　ＢＶＤＶ标准抗原　购于中国兽药监察所。1.3　ＢＶＤＶ＿ＭＡＢ　新疆农垦科学院畜牧兽医研究所单抗组研制。1.4　ＢＶＤＶ病毒样品的采集及检测　采集临床典型粘膜病患牛的粪样、血样、及脾脏、淋巴等组织 ,通过ＥＬＩＳＡ、琼脂扩散试验和对流免疫试验检测ＢＶＤＶ抗原和抗体。1.5　ＢＶＤＶ的ＭＤＢＫ细胞的单层培养　取患牛血液 ,脾脏和骨髓的研磨物 ,加双抗 ,分别接种ＭＤＢＫ单层细胞 ,加盖密封 ,37℃ 5%ＣＯ2 培养 4天 ,观察细胞生长情况 ,检测细胞培养上清中的ＢＶＤＶ抗原 ,收获细胞培养物 ,备用。1.6　ＢＶＤＶ毒价测定　采用间接过氧化物酶染色法 (ＤＡＢ染色法 ) [4 ] 测定毒价。1.7　ＢＶＤＶ电镜观察及理化特性的测定　取ＢＶＤＶ培养物 ,封片 ,电镜观察 ,并作对胰酶、乙醚和氟仿的敏感试验以及不同保存条件下的毒力试验1 .8　病毒回归试验　选取 5月龄羔羊和怀孕 4月龄左右的母羊 ,饲养观察 7天 ,临诊正常 ,通过ＥＬＩＳＡ和琼扩试验检测ＢＶＤＶ抗原和抗体均为阴性。先将 5月龄羔羊口腔接种患牛脾脏 ;随机选取怀孕母羊 ,2只静脉接种细胞培养物 ,1只接种ＢＶＤＶ标准抗原 ;1只作为阴性对照。1.9　试验动物样品的采集及检测　接毒后 ,观察记录体温、呼吸和心率变化 ,并在接毒后 10、15、2 0和2 5天采集粪样和血样 ,采用ＥＬＩＳＡ、琼扩法、对流免疫和ＢＶＤＶ＿ＭＡＢ检测ＢＶＤＶ抗原、抗体 ,剖杀后采集羔羊、母羊及胚胎的组织样品 ,进行酶免疫组织化学染色法 (ＤＡＢ染色法 ) ,确定ＢＶＤＶ抗原的分布情况。2　结　果2 .1　ＢＶＤＶ病毒样品的采集及检测　采集临床典型粘膜病患牛的粪样、血样及脾脏、淋巴等组织 ,通过ＥＬＩＳＡ、琼扩和对流免疫试验检测ＢＶＤＶ抗原、抗体。ＥＬＩＤＡ检测患牛粪样中的ＢＶＤＶ抗原 :Ｐ/Ｎ =4 .2 79(阴性对照Ｐ/Ｎ =0 .2 1) ,抗原检测阳性 ;血样中的ＢＶＤＶ抗体 :Ｐ/Ｎ =6.89(阴性对照Ｐ/Ｎ =0 .2 7) ,抗体检测阳性。琼扩法和对流免疫检测 :患牛粪样作 1 8稀释 ,离心 ,取上清 ,与猪抗ＢＶＤＶ抗体1 2和鼠抗ＢＶＤＶ抗体 1 8出现明显的沉淀线 ,患牛血样离心 ,取血清作 1 2稀释 ,与ＢＶＤＶ粗提抗原 1 1、1 2出现明显沉淀线 ,对流免疫 1 4也出现沉淀线。2 .2　ＢＶＤＶ的ＭＤＢＫ单层细胞培养及检测　取患牛血液 ,脾脏和骨髓的研磨物 ,加双抗 ,接种ＭＤＢＫ单层细胞 ,加盖密封 ,37℃ 5%ＣＯ2 培养 4天 ,连续盲传 4代 ,单层细胞均不出现病变 ,收获细胞培养物 ,反复冻融 3～ 4次 ,部分经 60 0 0ｒ/ｍｉｎ ,30分钟离心 ,通过ＢＶＤＶ＿ＭＡＢ检测ＢＶＤＶ抗原 ,Ｐ/Ｎ =30 .38(阴性对照Ｐ/Ｎ =1.2 4 ) ,细胞培养物ＢＶＤＶ强阳性。2 .3　ＢＶＤＶ毒价测定　采用间接过氧化物酶染色法测定ＢＶＤＶ毒价 ,结果 :该毒株从脾、骨髓中分离到的毒价最高 ,达 10 4 .5～ 10 4 .7ＴＣＩＤ50 ,成母牛血液次之 ,为 10 2 .85～ 10 2 .9ＴＣＩＤ50 ,犊牛血液毒价最低仅为10 0 .85ＴＣＩＤ50 。2 .4　ＢＶＤＶ电镜观察及理化特性的测定　取ＢＶＤＶ培养物 ,封片 ,电镜观察 ,该病毒为 30～ 80ｍμｍ的圆形颗粒 ,为有囊膜的ＲＮＡ病毒 ,该病毒对乙醚、氯仿敏感 ,对胰酶较敏感 ,56℃很快被灭活 ,低温稳定 ,血液和脏器中 - 2 0℃较稳定 ,细胞培养物 - 2 5℃保存18个月仍有很强的毒力。2 .5　病毒回归试验　 5月龄羔羊接毒后 ,出现一过性体温升高 ,并有严重的腹泻 ,ＥＬＩＳＡ、琼扩法和对流免疫法检测 ,粪样ＢＶＤＶ抗原阳性 ,血样ＢＶＤＶ抗体阳性。 2只怀孕母羊接毒后 1～ 8天 ,出现双相体温变化。其中 1只母羊产羔 ,初生羔羊严重腹泻 ,眼畸形。羔羊和 3只怀孕母羊于接毒后 10、15、2 0、2 5天分别采集血样 ,抗体ＥＬＩＳＡ检测均为阳性 ,琼扩试验检测 :血样 1 2、1 4与ＢＶＤＶ粗提抗原 1 2出现明显沉淀线。接毒后 10天采集的粪样 ,通过ＥＬＩＳＡ、琼扩可检出ＢＶＤＶ抗原 ,与ＨＲＰ标记的ＢＶＤＶ＿ＭＡＢ可特异性结合 ,Ｐ/Ｎ =7.19(阴性对照Ｐ/Ｎ =0 .2 17) ,抗原阳性 ,试验羊剖杀后 ,均有不同程度的病理变化。2 .6　试验动物样品的采集及检测　试验羊剖杀后 ,采集羔羊、母羊及胚胎的心 ,肝、脾、肺、肾、食管、气管、胃、肠、膀胱、淋巴结、甲状腺、胰腺、胸腺 (羔羊 )、大脑、小脑、脊髓、视神经、眼结膜等组织气管 ,采用ＢＶＤＶ＿ＭＡＢ酶免疫组织化学染色 (ＤＡＢ染色 )试验检测 ,所有样品均有不同程度的ＢＶＤＶ感染。3　小结和讨论3.1　本试验是在建立了 8株ＢＶＤＶ＿ＭＡＢ细胞株的基础上 ,通过用ＨＲＰ标记的单抗检测分离病毒 ,具有很高的特异性。 8株单抗经分析 ,可分别结合ＢＶＤＶ3个不同的抗原结合位点 ,试验中分别选取结合ＢＶＤＶ3个抗原位点的 3株单抗标记物 ,将其混合 ,进行检测 ,对ＢＶＤＶ的检出率和特异性有一定的保证。3.2　病毒回归试验 ,试验动物出现较为严重的临床症状 ,尤其是初生羔羊 ,严重腹泻。剖检变化 ,接种分离病毒的羊 ,其病理变化也较接种ＢＶＤＶ标准毒株的严重。ＭＤＢＫ单层细胞培养 ,盲传 4代 ,细胞无病变 ,且有较高的毒价。具文献报道 ,ＢＶＤＶ致病力强 ,细胞培养不致细胞病变的多属ＢＶＤＶ＿Ⅱ。由此看来 ,本试验分离到的ＢＶＤＶ很可能属ＢＶＤＶ＿Ⅱ型。3.3　本试验分离到的该ＢＶＤＶ毒株 ,其与ＢＶＤＶ标准毒株的基因序列差异 ,正在试验研究中牛病毒性腹泻病毒野毒株的分离鉴定@钟发刚$新疆农垦科学院畜牧兽医研究所!石河子832000 @王新华$新疆农垦科学院畜牧兽医研究所!石河子832000 @沈敏$新疆农垦科学院畜牧兽医研究所!石河子832000 @温建新$新疆农垦科学院畜牧兽医研究所!石河子832000 @张银国$新疆农垦科学院畜牧兽医研究所!石河子832000[1]北京医学院微生物教研组 .实验免疫学 ,北京 :人民卫生出版社 ,1980 . [2 ]沈正达 .甘肃畜牧兽医 ,1993,(6 ) :2 5 . [3]王治才 ,刘崇向 ,赵泽森 ,等 .中国畜禽传染病 ,1992 ,(3) :41～ 42 . [4]林志雄 ,霍燕琼 ,严爱莲 .西藏畜牧兽医 ,1994,(2 ) :71～ 75 .