文献类型: 中文期刊
作者: 马红霞 1 ; 孙华 1 ; 郭宁 1 ; 刘树森 1 ; 张海剑 1 ; 石洁 1 ;
作者机构: 1.河北省农林科学院植物保护研究所/农业农村部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室/河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心
关键词: 玉米南方锈病;多堆柄锈菌;常规PCR;巢式PCR
期刊名称: 中国农业科学
ISSN: 0578-1752
年卷期: 2023 年 009 期
页码: 1686-1695
收录情况: 北大核心 ; CSCD
摘要: 【目的】建立巢式PCR方法,快速检测处于病害潜育期的玉米叶片内的多堆柄锈菌(Puccinia polysora),为玉米南方锈病(southern corn rust)的预测和防治提供技术支持。【方法】根据多堆柄锈菌ITS区序列,在其变异区设计3条多堆柄锈菌特异性检测引物NX471-F、NX255-F和NX255-R,建立以NX471-F与真菌ITS区通用引物ITS4为外侧引物,NX255-F/NX255-R为内侧引物的巢式PCR。采用20μL扩增体系:Ex Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)0.15μL、10×Ex Taq Buffer(Mg2+plus)2μL,d NTP Mixture(各2.5 mmol·L-1)1.6μL,上下游引物(10μmol·L-1)各0.3μL,DNA 1μL,14.65μL ddH2O。扩增程序:利用外侧引物NX471-F/ITS4进行第一步PCR扩增,95℃预变性7 min;95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,30个循环;72℃再延伸7 min。将扩增后的产物稀释20倍,取1μL用作第二步PCR的扩增模板,然后以内侧引物NX255-F/NX255-R进行第二步PCR扩增,95℃预变性7 min;95℃变性30 s,66℃退火30 s,72℃延伸26 s,30个循环;72℃再延伸7 min。同时选用内侧引物进行常规PCR扩增,扩增体系同巢式PCR,扩增程序除循环数为38,其余程序同巢式PCR的第二步PCR检测。在此条件下对多堆柄锈菌、高粱柄锈菌(Puccinia sorghi)、青杨叶锈病菌(Melampsora laricipopulina)和7种玉米常见病原菌进行特异性检测,对不同梯度多堆柄锈菌基因组DNA和3种人工接种病叶进行灵敏度检测。【结果】巢式PCR检测体系仅在检测多堆柄锈菌时,产生了255 bp的目的条带,其他菌株均未扩增出目的条带。巢式PCR检测体系对多堆柄锈基因组DNA的最低检测限为10 fg·μL-1,是常规PCR检测体系灵敏度的500倍。当1 g人工接种病叶含500—2.5×10~4个多堆柄锈菌夏孢子时,常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别0和85.71%,巢式PCR可检测出的夏孢子个数最少为1 000个;当1 g人工接种病叶中含1—7个夏孢子堆时,常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别76.19%和100%,常规PCR可检测出的夏孢子堆个数最少为2个,巢式PCR可检测出1个及以上夏孢子堆;当1 g人工接种病叶中含1—7个侵染点时,常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别14.29%和66.67%,检测出的侵染点个数最少分别为6个和3个。【结论】成功建立了一种以NX471-F/ITS4为外侧引物,NX255-F/NX255-R为内侧引物的巢式PCR检测方法,可快速、高效、准确检测玉米叶片中潜伏期的多堆柄锈菌。
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