文献类型： 中文期刊

作者： 王鹏 ¹ ; 刘子嶷 ¹ ; 刘玉芳 ¹ ; 储明星 ¹ ;

作者机构： 1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/畜禽生物育种全国重点实验室

关键词： 山羊产羔数;卵巢颗粒细胞增殖;GAB2基因;miR-535;P13K/AKT信号通路

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2023 年 023 期

页码： 4757-4771

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【背景】MicroRNA（miRNA）是长度为18—25 nt的短RNA分子，在哺乳动物卵巢颗粒细胞调控卵泡发育过程中起着重要作用。团队前期对云上黑山羊高、低产羔数个体卵巢转录组测序结果显示，miR-535能够影响山羊产羔数，但具体调控机制尚不清楚。【目的】通过研究miR-535靶向GAB2（GRB2 associated binding protein 2）及其相关信号通路PI3K/AKT对山羊颗粒细胞增殖的影响，进一步探讨其分子生物学调控机制。【方法】在本研究中，选择具有两胎以上产羔记录的高、低产云上黑山羊各3只，同期发情处理后采集卵泡期卵巢组织，收集原代颗粒细胞。使用荧光定量PCR（reverse transcription-quantitative PCR,RT-qPCR）检测miR-535和GAB2在云上黑山羊高、低产卵巢组织中的表达量。构建GAB2的过表达/干扰载体，使用RT-qPCR、Western blot、免疫荧光、CCK8、EdU和细胞凋亡检测候选基因GAB2对山羊卵巢颗粒细胞增殖的影响。使用miRDB和miRanda软件预测miR-535和GAB2的靶向关系，构建GAB2的野生型和突变型载体，利用双荧光素酶活性检验检测miR-535和GAB2的靶向关系。构建过表达/干扰miR-535载体，探究其颗粒细胞增殖及下游基因功能的影响。【结果】RT-qPCR结果显示，GAB2在高产云上黑山羊卵巢组织中的表达量显著低于低产个体，miR-535的表达则相反（P＜0.05）；随后，RT-qPCR和Western blot结果表明，在颗粒细胞中过表达GAB2后，CCND2、CDK4和BCL2的表达量显著升高（P＜0.05）,BAX的表达量显著降低（P＜0.05），抑制其表达则与之相反；EdU和CCK8检测显示，GAB2过表达后显著促进颗粒细胞增殖（P＜0.05），抑制其表达后则相反；双荧光素酶报告试验表明，miR-535抑制了GAB2基因3’UTR区域的双荧光素酶活性。RT-qPCR和Western blot结果显示，在颗粒细胞中过表达miR-535后，GAB2、CCND2、CDK4和BCL2的表达量显著降低（P＜0.05）,BAX的表达量显著升高（P＜0.05），抑制其表达后则与之相反；EdU和CCK8检测显示，miR-535过表达后抑制颗粒细胞增殖，抑制其表达后则相反；细胞凋亡试验表明，miR-535过表达后促进颗粒细胞增殖，抑制其表达后则相反。在颗粒细胞中抑制miR-535后，发现PI3K/AKT信号通路标志因子AKT1的表达水平显著升高（P＜0.05）。【结论】miR-535通过抑制GAB2的表达，抑制了山羊颗粒细胞的增殖，为进一步探究miR-535调控山羊颗粒细胞的生物学功能提供了理论依据。