文献类型： 中文期刊

作者： 池润清 ¹ ; 韩海银 ¹ ; 王鹏 ¹ ; 李凯扬 ¹ ; 储明星 ¹ ; 刘玉芳 ¹ ;

作者机构： 1.河北工程大学生命科学与食品工程学院;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/农业农村部动物遗传育种与繁殖重点实验室;北京市畜牧总站

关键词： 绵羊;肌肉发育;雌激素;circZNF423;oar-miR-541-3p;CALM3

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2024 年 57 卷 003 期

页码： 597-612

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： [背景]雌激素是雌性哺乳动物卵巢组织分泌的主要激素,其对肌肉的生长发育起着重要的调控作用,circRNA 已被发现参与多种与肌肉生长发育相关的信号通路.[目的]根据团队前期卵巢摘除苏尼特羊与假手术苏尼特羊全转录组整合分析发现circZNF423 可作为内源性竞争RNA(ceRNA)调控oar-miR-541-3p/CALM3的表达.为进一步探究雌激素在绵羊肌肉生长中分子机制,通过体外培养绵羊原代成肌细胞,检测成肌细胞中外源添加雌激素介导 circZNF423 调控oar-miR-541-3p/CALM3对成肌细胞增殖的影响,为进一步研究雌激素及circRNA在绵羊生长发育性状中的作用机制提供理论依据,为绵羊分子设计育种提供新的研究思路.[方法]采集绵羊背最长肌组织,对绵羊原代成肌细胞进行体外分离培养,通过免疫荧光染色、RNA原位杂交(FISH)和核质分离试验确定circZNF423 在成肌细胞中的表达位置;RNAhybrid在线软件预测circZNF423、oar-miR-541-3p和CALM3存在结合关系,通过双荧光素酶活性检测和生物素标记的miRNA下拉试验验证circZNF423 和oar-miR-541-3p、oar-miR-541-3p和CALM3结合情况;体外构建合成circZNF423 过表达或干扰载体、oar-miR-541-3p 的模拟物(mimics)或抑制剂(inhibitor)、CALM3过表达或干扰载体,在绵羊原代成肌细胞中进行转染,利用RT-qPCR、Western blot、EdU和CCK-8 检测绵羊成肌细胞增殖标志因子的表达和成肌细胞增殖情况;为进一步明确雌激素在绵羊肌肉生长发育中的作用,体外添加不同浓度的外源性雌二醇(E2),利用RT-qPCR、Western blot、CCK-8 和EdU检测绵羊肌细胞增殖标志基因的表达变化.[结果]免疫荧光染色显示分离的原代细胞为绵羊成肌细胞,可用于后续功能验证;RNA原位杂交和核质分离试验表明,circZNF423 主要在绵羊成肌细胞质中表达.RNAhybrid、双荧光素酶活性检测和生物素标记的miRNA下拉试验结果表明,circZNF423 与oar-miR-541-3p、oar-miR-541-3p与CALM3 3'UTR之间均存在显著的结合关系;抑制 circZNF423/CALM3表达或过表达 oar-miR-541-3p后,绵羊成肌细胞增殖标志因子PCNA、CDK2和 Pax7 mRNA 与蛋白表达水平一致,均显著上调(P<0.05 或 P<0.01);EdU 和 CCK8 结果表明,抑制circZNF423/CALM3表达或过表达oar-miR-541-3p后,绵羊成肌细胞增殖率显著上升(P<0.05);过表达circZNF423/CALM3或抑制oar-miR-541-3p后则相反.添加不同浓度外源雌二醇(E2)后,在浓度为 10 nmol·L-1 时绵羊成肌细胞增殖标志因子表达最高,显著高于 1 和 100 nmol·L-1 的添加浓度(P<0.05 或P<0.01);绵羊肌细胞增殖标志因子 PCNA、CDK2和Pax7 mRNA和蛋白表达水平一致,均显著上调,circZNF423 和CALM3的表达量显著降低,oar-miR-541-3p的表达量显著升高(P<0.05 或P<0.01);EdU和CCK8 结果显示,体外添加雌二醇后绵羊成肌细胞增殖率显著升高(P<0.05).[结论]绵羊成肌细胞中 circZNF423 作为 ceRNA 调控 oar-miR-541-3p 和 CALM3的结合及表达,添加外源雌激素可通过抑制circZNF423/oar-miR-541-3p/CALM3通路促进绵羊肌肉细胞的增殖.这些结果为揭示雌激素及circZNF423 在绵羊骨骼肌发育性状中的分子机制提供理论基础.