文献类型： 中文期刊

作者： 沈兆基 ¹ ; 谢春嫡 ² ; 沙嘎那日·吉日木图 ² ; 郭肖蓉 ¹ ; 周荣 ² ; 李奎 ² ;

作者机构： 1.佛山科学技术学院

2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

关键词： 猪;非洲猪瘟病毒;蛋白结构;真核表达载体

期刊名称： 农业生物技术学报

ISSN： 1674-7968

年卷期： 2023 年 005 期

页码： 1100-1110

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是一种对猪（Sus scrofa）具有毁灭性的疾病，通常引发出血热，对养猪业危害巨大。多基因家族（multigene families, MGF） 505-5R位于非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）基因组右侧可变区域（the right variable region, RVR），能够影响病毒的毒力。本研究旨在分析MGF505-5R基因和蛋白的分子特征，构建MGF505-5R基因真核表达载体。根据ASFV参考基因组（GenBank No. MK128995.1）提取MGF505-5R基因序列进行生物信息学分析，并合成MGF505-5R基因片段。通过同源重组的方式将MGF505-5R基因连接至pRK5M-C-2×Strep载体。经PCR和测序鉴定后，将重组质粒pRK5M-C-2×Strep-MGF505-5R转染至猪小肠上皮细胞系（porcine intestinal columnar epithelial cells, IPEC-J2）中，通过免疫荧光和Western blot检测MGF505-5R的基因表达效果。通过qPCR检测过表达p RK5M-C-2×Strep-MGF505-5R的IPEC-J2细胞中外切体（exosome） 8个亚基、Mtr4外切体RNA解旋酶（Mtr4 exosome RNA helicase, MTREX）、末端核苷酸转移酶4A （terminal nucleotidyltransferase 4A,TENT4A）、锌指DHHC型棕榈酰转移酶16 （zinc finger DHHC-type palmitoyltransferase 16, ZDHHC16）基因的表达。生物信息学分析结果表明，MGF505-5R基因在系统发育树中分为3个分支，MGF505-5R蛋白在20、105和485位氨基酸存在正向选择。MGF505-5R蛋白的二级结构与三级结构相符，正选择位点均位于无规则卷曲上。PCR结果显示MGF505-5R基因片段成功连接至pRK5M-C-2×Strep载体中。免疫荧光和Western blot检测结果显示，MGF505-5R蛋白能够在猪IPEC-J2细胞中表达。qPCR结果显示，过表达pRK5M-C-2×Strep-MGF505-5R的IPEC-J2细胞中外切体组分（exosome component, EXOSC） 1、EXOSC2、EXOSC3、EXOSC4、EXOSC5、EXOSC7、EXOSC8、EXOSC10、TENT4A和ZDHHC16的表达量极显著降低（P＜0.01）;MTREX的表达量无显著变化。本研究对MGF505-5R分子特征的分析，为该基因的进化研究提供基础；构建MGF505-5R在猪IPEC-J2细胞的表达载体，为ASFV与宿主之间的蛋白质相互作用研究提供有效的工具和实验素材。