文献类型： 中文期刊

作者： 何聆瑜 ¹ ; 祖浩宇 ¹ ; 王宁 ¹ ; 杨光璞 ¹ ; 杜承 ¹ ; 王晓钧 ¹ ; 郭巍 ¹ ;

作者机构： 1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

关键词： 马链球菌马亚种;多组分融合蛋白;亚单位疫苗

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2023 年 45 卷 002 期

页码： 191-200

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 马腺疫是由马链球菌马亚种(S.equi)引起的急性接触性马属动物传染病,严重影响幼驹的生长发育.我国尚无预防该病的有效疫苗,也缺乏S.equi动物感染和免疫保护模型.为在原核系统中表达马链球菌马亚种(S.equi)的多组分融合蛋白,并评价其对小鼠的免疫保护效果,本研究以S.equi HLJ2018株DNA为模板,分别经PCR扩增其cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE基因,并分别克隆至pGEX-6p-1载体中,构建表达这8个蛋白的重组质粒并分别经PCR和测序鉴定.通过在各基因之间引入蛋白接头Gly-Gly-Gly编码基因序列并利用同源重组技术依次串联该8个基因,得到融合基因se8,利用其构建重组质粒pET-28a-SE8(His标签)及pGEX-6p-1-SE8(GST标签),均经PCR和测序鉴定后,将这两个表达SE8及分别表达该8个蛋白的重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后采用亲和柱层析法纯化,采用SDS-PAGE检测各蛋白的表达及纯化效果;采用western blot检测各蛋白的反应原性.SDS-PAGE结果显示,获得分子量约181 ku的His标签融合8组分重组蛋白SE8(His-SE8)、204 ku的GST标签融合8组分重组蛋白SE8(GST-SE8)及8个单组分重组蛋白,且上述蛋白均以可溶性形式表达;Western blot结果显示,8个单组分重组蛋白均能够与自然感染S.equi的马阳性血清反应,His-SE8能够与自然感染S.equi 的马阳性血清反应,GST-SE8能够与感染S.equi 小鼠的阳性血清反应.上述结果表明,8个单组分重组蛋白及SE8均获得了表达,且纯化效果和反应原性均较好.以纯化的His-SE8(100 μg)添加明矾佐剂后免疫小鼠,利用间接ELISA(iELISA)分别检测免疫后小鼠血清中9种重组蛋白的特异性抗体及His-SE8特异性抗体亚型水平;免疫后28 d,以10倍最小完全致死剂量(MLD)的S.equi 攻击小鼠后评价His-SE8的免疫保护效果,连续14 d每天监测小鼠临床症状、体质量变化和存活率.iELISA结果显示,His-SE8免疫组小鼠可产生该9种蛋白的特异性抗体,其中EQ5、EQ8和CNE的抗体水平较高,SclF、SclI和IdeE的抗体水平较低,SclC、EAG和His-SE8的抗体水平居中,且His-SE8特异性IgG1水平极显著高于IgG2a和IgG2b水平(P<0.0001);免疫保护实验结果显示,攻菌后3 d免疫组小鼠临床症状缓解,其体质量在攻菌后4 d~8 d恢复正常,存活率达100%;对照组小鼠体质量持续下降,且攻菌后7 d内全部死亡.上述结果表明,His-SE8具有较强的免疫调节和免疫原性,能够诱导小鼠产生高水平的体液免疫应答,具有良好的免疫保护效果.本研究为马腺疫亚单位疫苗的研究提供了参考依据.